Дерматан сульфат что это

Гликозаминогликаны (мукополисахариды)

Гликозаминогликаны соединительной ткани – это линейные неразветвлен-ные полимеры, построенные из повторяющихся дисахаридных единиц. В организме гликозаминогликаны не встречаются в свободном состоянии, т.е. в виде «чистых» углеводов. Они всегда связаны с большим или меньшим количеством белка. В их состав обязательно входят остатки мономера либо глюкозамина, либо галактозамина. Второй главный мономер дисахаридных единиц также представлен двумя разновидностями: D-глюкуроновой и L-идуроновой кислотами. В настоящее время четко расшифрована структура шести основных классов гликозаминогликанов (табл. 21.2).

Гиалуроновая кислота впервые была обнаружена в стекловидном теле глаза. Из всех гликозаминогликанов гиалуроновая кислота имеет большую мол. массу (100000–10000000). Доля связанного с гиалуроновой кислотой белка в молекуле (частице) протеогликана составляет не более 1–2% от его общей массы. Считают, что основная функция гиалуроновой кислоты в соединительной ткани – связывание воды.

В результате такого связывания межклеточное вещество приобретает характер желеобразного матрикса, способного «поддерживать» клетки. Важна также роль гиалуроновой кислоты в регуляции проницаемости тканей. Приводим структуру повторяющейся дисахаридной единицы в молекуле гиалуроновой кислоты:

Хондроитин-4-сульфат и хондроитин-6-сульфат построены по одному плану. Отличие между ними заключается в локализации сульфатной группы. Несмотря на минимальные различия в химической структуре, физико-химические свойства хондроитин-4-сульфата и хондроитин-6-сульфата существенно различаются; последние различаются также распределением в разных видах соединительной ткани (табл. 21.3).

Дерматансульфат особенно характерен для дермы (кожи). Он резистентен к действию гиалуронидаз (тестикулярной и бактериальной). В этом одно из отличий дерматансульфата от хондроитинсульфатов. Кроме того, в состав дисахаридной единицы дерматансульфата входит L-идуроновая, а не D-глюкуроновая кислота (в малом количестве D-глюкуроновую кислоту можно обнаружить в повторяющихся единицах дерматансульфата):

О биологической роли дерматансульфата почти ничего неизвестно. Роль этого гликозаминогликана не может быть сведена только к стабилизации коллагеновых пучков, так как дерматансульфат обнаруживается и в тканях эктодермального происхождения, не содержащих коллагена.

Кератансульфат впервые был выделен из роговой оболочки глаза быка, отсюда и название этого гликозаминогликана. В противоположность всем остальным гликозаминогликанам кератансульфат не содержит ни D-глю-куроновой, ни L-идуроновой кислоты:

Установлено, что кератансульфат, выделенный из роговицы глаза (кера-тансульфат I), и кератансульфат, полученный из хрящевой ткани (кера-тансульфат II), различаются по степени сульфатированности и строению связи между кератансульфатом и пептидной частью протеогликана.

Гепарин известен прежде всего как антикоагулянт. Однако его следует относить к гликозаминогликанам, так как он синтезируется тучными клетками, которые являются разновидностью клеточных элементов соединительной ткани. Он может входить в состав протеогликанов; с гликоз-аминогликанами его объединяет и химическая структура.

Гепаринсульфат в отличие от гепарина в дисахаридных единицах чаще содержит N-ацетильные группы, чем N-сульфатные. Кроме того, степень О-сульфатирования гепаринсульфата ниже, чем гепарина.

Биосинтез гликозаминогликанов. Известно, что синтез глюкозамина и глюкуроновой кислоты, входящих в состав гиалуроновой кислоты, происходит из D-глюкозы. Непосредственные предшественники гиалуро-новой кислоты – нуклеотидные (уридиндифосфонуклеотидные) производные N-ацетилглюкозамина и глюкуроновой кислоты.

Предшественником углеводных остатков сульфатированных гликоза-миногликанов, как и у гиалуроновой кислоты, является молекула D-глю-козы. Далее происходит эпимеризация глюкозамина в галактозамин, а глюкуроновой кислоты при синтезе дерматансульфата – в идуроновую кислоту. Нуклеотидные производные этих соединений утилизируются при биосинтезе сульфатированных гликозаминогликанов, при этом сульфат включается в биосинтез гликозаминогликанов в виде 3′-фосфоаденозин-5′-фосфосульфата (ФАФС). В процессе биосинтеза гликозаминогликанов принимает участие большое количество различных ферментов, в том числе трансфераз.

Источник

Дерматансульфат: состав, структура, биологическая роль, применение в медицине

Дерматансульфат как полисахарид линейного строения, относящийся к классу кислых гликозаминогликанов, содержащийся в коже, сухожилиях, связках млекопитающих и человека. Химическое строение и свойства, а также оценка биологической роли данного соединения.

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Дерматансульфат: состав, структура, биологическая роль, применение в медицине

В последние годы проявляется большой интерес к получению и исследованию биологических свойств кислых гликозаминогликанов, модифицированных по карбоксильной функции. Модификация полисахаридов позволяет изменить их физико-химические и биологические свойства, конъюгаты полисахаридов с лекарственными субстанциями могут обладать большей растворимостью или продолжительностью действия по сравнению с самими лекарствами, могут использоваться как препараты комбинированного действия. Способ получения модифицированного дерматансульфата (из свиной кожи) путем его взаимодействия с соединениями, содержащими первичную аминогруппу (RNH2), в водной среде, при различных соотношениях реагентов. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 30 минут с образованием соответствующих конъюгатов с высокой конверсией карбоксильных групп дерматансульфата.

дерматансульфат полисахарид биологический медицина

О биологической роли дерматансульфата почти ничего неизвестно. Роль этого гликозаминогликана не может быть сведена только к стабилизации коллагеновых пучков, так как дерматансульфат обнаруживается и в тканях эктодермального происхождения, не содержащих коллагена.

Хондроитинсульфат В, или дерматансульфат, вначале был выделен из кожи свиньи, а затем обнаружен в сухожилиях, клапанах сердца и аорте. Он содержится также в селезенке, мозге, выйной связке, где составляет 50% общего количества кислых полисахаридов. Содержание дерматансульфата, по-видимому, увеличивается с возрастом.

Размещено на Allbest.ru

Подобные документы

презентация [348,0 K], добавлен 05.04.2016

Строение тела пчелы. Жизнь пчелиной семьи. Состав, виды и свойства меда. Основные свойства пчелиного воска. Пыльца и перга, их польза. Состав пчелиного яда, его действие на человеческий организм. Лечебные свойства прополиса, применение. Маточное молочко.

курсовая работа [63,2 K], добавлен 19.06.2010

Строения и активные формы аскорбиновой кислоты. Биосинтез в растениях. Биологическая роль жизнедеятельности организма человека. Содержание в некоторых пищевых продуктах. Применение витамина С в медицине и его источники среди растительных культур.

курсовая работа [1,8 M], добавлен 07.03.2015

Биологическая активность токоферола, его свойства и химическое строение. Значение витамина Е для регенерации тканей и улучшения кровообращения, его влияние на беременность и репродуктивную систему. Источники витамина Е. Признаки дефицита токоферола.

презентация [1,6 M], добавлен 09.11.2015

Наперстянка пурпуровая: химический состав; применение в медицине; технология возделывания. Корневая система родиолы розовой. Корневища и корни мыльнянки, применение в медицине. Полезные свойства девясила. Фармакологические свойства барвинка малого.

контрольная работа [59,4 K], добавлен 12.07.2011

Источник

Дерматансульфат или его соль, противотромбозные средства, способ предупреждения или лечения тромбозов, способ предупреждения или лечения синдрома рассеянной интраваскулярной коагуляции, способ лечения инфаркта миокарда

Описывается дерматансульфат или его соль, имеющий характеристическую вязкость 0,8 (100 мл/г) или выше при определении вискозиметром Уббелоне с применением в качестве растворителя 0,2 М раствора хлорида натрия при температуре 30 0,1 o С, при этом указанный дерматансульфат содержит 0,15% или менее гепарина или гепаран сульфата при определении способом, включающим обработку ферментами расщепления гепарина или гепаран сульфата и жидкостную хроматографию высокого разрешения, 0,07% или менее гепарина или гепаран сульфата, определяемого по ингибирующему действию активного фактора Х в присутствии антитромбина III с применением гепарина, выделенного из коровьих кишок в качестве стандартного вещества, или 0,05% или менее гепарина или гепаран сульфата, определяемого по ингибирующему действию активного фактора II в присутствии антитромбина III при использовании в качестве стандартного вещества гепарина, выделенного из коровьих кишок. Дерматансульфаты или их соли относятся к противотромбозным средствам, которые препятствуют распространению тромбов и стимулируют их лизис. Описываются также противотромбозные средства, способ предупреждения или лечения синдрома рассеянной интраваскулярной коагуляции и способ лечения инфаркта миокарда. 6 с. и 12 з.п. ф-лы, 8 табл., 6 ил.

Настоящее изобретение относится к противотромбозным средствам, которые препятствуют распространению тромбов и стимулируют их лизис.

Сообщается, что дерматансульфаты усиливают антикоагуляционную активность через кофактор II гепарина, но сообщается об их фибринолитической активности, ускорении выведения t-PA/Abbadini, M. et al, Blood 1987, 70, 1858-1860/, в то время как сообщается, что дерматансульфаты не влияют на количество t-PA или фибринолитическую активность /Tripodi, A. et al., Thromb. Res., 1991, 62, 663-672/, и точное действие на фибринолитическую систему остается неясным.

Дерматансульфаты, которые используют в различных разработках в экспериментах и в качестве медицинских препаратов, получают из свиных или коровьих кишок или кожи /Fareed, J. et al., Recent Advance in Blood Coagulation, 1993, 6, 169-187/. Известно, что дерматансульфаты из других источников не имеют активности.

Настоящее изобретение относится к противотромбозным средствам, содержащим в качестве эффективного ингредиента дерматансульфаты, или к комбинированному использованию дерматансульфатов с тканевым плазминогенным активатором /t-PA/.

Дерматансульфаты могут быть получены главным образом из сырья, происходящего от млекопитающих или других животных, такого как коровья или свиная слизистая кишок или кожа или куриные гребни, Авторы настоящего изобретения нашли, что активация плазминогена одно- или двухцепным t-PA может быть усилена в присутствии дерматансульфатов, полученных из такого сырья, или их фармакологически приемлемых солей, по сравнению со случаем их отсутствия. Кроме того, авторы настоящего изобретения также обнаружили, что специфические дерматансульфаты настоящего изобретения, имеющие характеристическую вязкость 0,8 (100 мл/г) или более, предпочтительно 0,9-2,0 (100 мл/г), получаемые из куриных гребней, с 2-7% Di-OS, предпочтительно с 3-6%, в своем составляющем дисахариде, и со средней молекулярной массой 25000-100000, предпочтительно 30000-60000, дальтон, определяемой гель-фильтрацией, описанной в Biochem. Bicphys. Acta, 1117, 60-70 (1992), в особенности те из них, которые имеют низкое содержание гепарина или гепаран cульфата, или их фармакологичеcки приемлемые соли, введенные в живой организм, могут сохраняться более длительное время в крови, чем другие дерматансульфаты, и обнаруживают фармакологическое действие, проявляющееся во всесторонней противотромбозной активности не только с фибринолитическим действием, но также и c антикоагулирующим действием, и это является основой настоящего изобретения.

Фармакологически приемлемые соли дерматансульфатов включают такие соли, как соли натрия, калия, лития и кальция, но обычно вводят натриевые соли. Тканевые плазминогенные активаторы /t-PA/, применяемые для настоящего изобретения, включают как эндогенные, так и экзогенные, одно- и двухцепные, и природные и ген-рекомбинантные продукты. Кроме того, t-PA-аналоги с частично неполным аминокислотным составом или имеющие избыток аминокислот также могут использоваться до тех пор, пока они обнаруживают свойства активирования плазминогена /см. EP-A-112122].

Дерматансульфаты или их фармакологически приемлемые соли, далее называемые DC, обнаруживают в достаточной степени свою фармакологическую активность при однократном и единственном, или редком, или повторяющемся введении. Дерматансульфаты могут вводиться посредством внутривенных, внутриартериальных или внутрикоронарно-артериальных инъекций и могут применяться подкожно или внутримышечно. DC и t-PA могут вводиться одновременно одними и теми же путями или могут вводиться отдельно.

Фармацевтические препараты дерматансульфатов могут быть подходящим образом приготовлены с обычными фармацевтически приемлемыми адъювантами, такими как стабилизаторы, эмульгаторы, регуляторы осмотического давления, pH-коррегирующие средства и так далее.

Как упоминалось выше, DC или их фармакологически приемлемые соли могут применяться для активирования фибринолитической активности в качестве пригодного тромболитического ускорителя. Особенно заметное действие обнаруживают специфические DC настоящего изобретения, имеющие характеристическую вязкость 0,8-2,0 (100 мл/г), получаемые из куриных гребней, имеющие степень Di-OS 2-7% в своем составляющем дисахариде или имеющие среднюю молекулярную массу 25000-100000, определяемую способом, описанным далее, и особенно те из них, которые имеют низкое содержание гепарина или гепаран сульфата, или их фармакологически приемлемые соли. В то же время DC, имеющие характеристическую вязкость свыше 2,0 на 100 мл/г, или среднюю молекулярную массу свыше 100000, в высококонцентрированных растворах показывают повышенную вязкость и не рекомендуются вследствие нарушения скорости тока крови. Кроме того, одновременное введение описанных выше DC или их фармакологически приемлемых солей и t-PA заметно увеличивает тромболитическую активность и может снизить дозу t-PA для лечения или предупреждения тромбоза как подходящего тромболитического средства.

В частности, упомянутые выше специфические DC или их фармакологически приемлемые соли настоящего изобретения при введении в живой организм сохраняют эффективную концентрацию в крови в течение более длительного периода, чем другие DC или их фармакологически приемлемые соли, и предупреждают распространение и ингибируют образование тромбов или стимулируют тромболиз. Таким образом, они отлично действуют против синдрома рассеянной интраваскулярной коагуляции /DIC/, множественного повреждения органов, связанного с многочисленными тромбами, и глубокого тромбоза вен и т.п. Такие результаты могут наблюдаться не только в случае вышеупомянутых заболеваний, но также и при всех типах тромбов, что служит основанием для применения при лечении и предупреждении образования тромбов в артериях, капиллярах и венах. Кроме того, специфические DC или их фармакологически приемлемые соли настоящего изобретения могут применяться для предупреждения образования сгустков крови при искусственном кровообращении, таком как гемодиализ для пациентов, страдающих от почечных заболеваний.

Гепарин /далее обозначаемый Геп/ или гепаран сульфат /далее обозначаемый ГС/, присутствующие как примеси в DC, могут быть удалены, чтобы получить DC, свободный от Геп или ГС /далее обозначаемый DS-H(-)/. Интраваскулярная, подкожная или внутримышечная инъекция получающегося в результате DS-H(-) снижает возможность побочных реакций, таких как кровотечение. В частности, введение DS-H(-) пациентам с тенденцией к кровотечениям вследствие пониженного содержания тромбоцитов и факторов коагуляции снижает возникновение побочных реакций, таких как кровотечение, и является особенно безопасным.

Краткое описание рисунков На фиг. 1 показано изменение в крови у крыс концентрации дерматансульфатов натрия, полученных из петушиных гребней /см. ссылочный пример 1, RCDS/ и из тонких кишок коровы /см. ссылочный пример 2, BIDS/ /см. пример 1/.

Фиг. 3 показывает степень стимулирования BIDS активации плазминогена двухцепным тканевым плазминогенным активатором /tc-tPA/.

Фиг. 4 показывает степень стимулирования RCDS активации плазминогена sc-tPA.

Фиг. 5 показывает степень стимулирования RCDS активации плазминогена tc-tPA.

Фиг. 6 показывает стимулирующее действие лизиса BIDS на сгусток плазмы человека.

Настоящее изобретение будет пояснено, с практической точки зрения, следующими далее ссылочными примерами и примерами.

Оставляют 5 г высушенного осадка стоять в 125 мл воды в течение ночи, и небольшое количество нерастворившегося осадка удаляют центрифугированием при 10 o C при 10000 об/мин в течение 15 минут. Супернатант разбавляют 125 мл 10% водного раствора ацетата натрия, смешивают с этанолом на ледяной бане до получения конечной концентрации 45% и оставляют стоять при 4 o C в течение 20 часов. Осадки от центрифугирования последовательно промывают 90% этанолом, чистым этанолом и эфиром и сушат над пентоксидом фосфора при пониженном давлении, получают чистую натриевую соль DC /далее называемую RCDS/.

Выделение и очистку дерматансульфатов из куриных гребней можно выполнить не только описанным выше способом, но также способами, описанными в рассмотренных опубликованных заявках на патент Японии NN 9042 (1985) и 21241 (1986).

2/ Удаление из DC гепарина /Геп/ и гепаран сульфата /Гс/ Небольшое количество Геп и ГС, содержащихся в DC в качестве примесей, можно удалить одним из описанных далее способов.

1/ Метод ионообменной хроматографии Пятьдесят грамм RCDS, полученного по предшествующему способу /1/, помещают в колонку 4,5 х 27 см с анионообменной смолой Diaio RTM HPAII /Mitsubishi Kasei Corp./, предварительно уравновешенную 1,1 М NaCl, промывают 8 л 1,1 М раствора NaCl и элюируют 8 л 1,5 М раствора NaCl. Объединенные элюаты конденсируют на роторном испарителе, диализуют и осаждают посредством добавления этанола до 42%, или лиофилизуют, и получают стандартный RCDS/RCDS-H(-)/, свободный от Hep и HS.

Ссылочный пример 2 Получение DC из слизистой тонких кишок коровы Десять килограммов коровьих тонких кишок рубят на куски с последующим удалением фекалий и жира и затем отделяют мукозу. Мукозу смешивают с NaOH, доводят объем до 3 л 2,5 N раствором NaOH и экстрагируют при 37 o C в течение 2 часов. Экстракт нейтрализуют, фильтруют через диатомовую землю, диализуют и центрифугируют, получают супернатант. Супернатант смешивают с равным количеством этанола и 5 г ацетата натрия, и получают осадок. Собранный осадок растворяют в 0,65 М растворе NaCl, и затем, подобно тому, как поступают в ссылочном примере 1, выливают в колонку с анионообменной смолой. Колонку последовательно прорывают 0,65 М и 1,1 М растворами NaCl и элюируют 1,5 М раствором NaCl. Объединенную фракцию элюатов диализуют против дистиллированной воды, и диализат смешивают с ацетатом кальция и уксусной кислотой до конечных концентраций 5% и 0,5 М соответственно. К раствору добавляют этанол, и собирают фракцию, осевшую при 15-30 об.%. Собранный осадок переводят в форму натриевой соли ионообменной смолой, промывают и сушат таким же способом, что и в ссылочном примере 1, и получают натриевую соль DC /называемую далее BIDS/.

Геп и ГС удаляют из BIDS таким же способом, как в ссылочном примере 1/2 /2/, и получают BIDS-H(-).

Осуществляют сравнение характеристик дерматансульфатов с характеристиками дерматансульфатов, полученных из мукозы кишок свиньи /Celsus Lab. Inc., распространяемых Cosmobio Co., Ltd./ и из свиной кожи /Seikagaku Corp./.

Ссылочный пример 3
Сравнение физико-химических свойств различных дерматансульфатов различного происхождения
1/ Определение средней молекулярной массы
Среднюю молекулярную массу DC определяют в соответствии со способом Arai et al. /Biochem. Biophys. Acta, 1117. 60-70, 1992/. Т.е. применяют гель-фильтрацию с жидкостной хроматографией высокого разрешения /ЖХВР/, используя в качестве стандартного образца гликозаминогликаны с известной молекулярной массой, и определяют молекулярную массу, исходя из их соответственно элюированных фракций. Готовят ряд колонок TSK_гельG4000PWX_L, G3000PWX_L и G2500PWZ_L /TOSOH Corp./ с внутренним диаметром 7,8 мм и длиной 300 мм, соответственно, элюируют 0,2 М раствором NaCl при скорости истечения 0,6 мл/мин, и проводят детектирование с дифференциальным рефрактометром.

2/ Анализ состава дисахаридов
Определение места частицы серной кислоты в DS осуществляют в соответствии с New Biochemical Experiments 3 Saccaride II, pp, 49-62 (1991) /публ. Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd./. Для этого DS переваривают с хондроитиназой ABC, и полученный дисахарид, имеющий ненасыщенную связь /ненасыщенный дисахарид/, анализируют ЖХВР и сравнивают с анализом вышеупомянутого ненасыщенного дисахарида, обработанной хондро-6-сульфатазой. Условия переваривания с хондроитиназой ABC, десульфирования с хондро-6-сульфатазой и анализа ЖХВР приводятся ниже.

а/ Переваривание с хондроитиназой ABC
В соответствии с методикой Yoshida /Anal. Biochem., 77, 327-332 (1989)/, в 20 мкл 10 мг/мл водного раствора DC добавляют 20 мкл 0,4 М трис-HCl-буфера /pH 8,0/, 20 мкл 0,4 M раствора ацетата натрия, 20 мкл 0,1% коровьего сывороточного альбумина и 120 мкл воды, затем добавляют 20 мкл 5 E/мл хондроитиназы ABC и инкубируют при 37 o C в течение 2 часов.

b/ Переваривание с хондро-6-сульфатазой
В 100 мкл упомянутого выше продукта переваривания с хондроитиназой ABC добавляют 20 мкл 5 E/мл хондро-6-сульфатазы, растворенной в 20 мМ трис-уксуснокислотном буфере /pH 7,0/, и инкубируют при 37 o C в течение 2 часов.

с/ Анализ ЖХВР
Пятьдесят микролитров раствора, переваренного с хондроитиназой ABC или переваренного затем с хондро-6-сульфатазой, анализируют на аппаратуре для ЖХВР /Hitachi Ltd. /. Используют ионообменную колонку /УМС-Pack PA-120S5, внутренний диаметр 2,6 мм, длина 250 мм/, и определяют поглощение при 232 нм. Элюирование выполняют при скорости потока 1,5 мл/мин с градиентом концентрации 800 мМ гидрофосфата натрия от 0% до 100% в течение 60 минут. Идентифицируют пики элюированных ненасыщенных дисахаридов, содержащих сернокислотные остатки в различных местах.

4/ Результаты
Результаты экспериментов (1)-(3) суммируют в табл. 1. Средняя молекулярная масса Dc, полученных из куриных гребней, составляет 38000 дальтон при характеристической вязкости 1,21. В противоположность этому три других DC имеют совершенно отличающиеся физико-химические свойства и показывают среднюю молекулярную массу 14000-16000 и характеристическую вязкость 0,44-0,68, что свидетельствует о заметном различии между DC, полученными из куриных гребней, и DC, полученными из других источников. Средняя молекулярная масса DC, полученных из коровьих и свиных тонких кишок, составляет 16000 и 18500 соответственно по способу настоящего изобретения, как видно из табл. 1, хотя есть сообщения, что она составляет 25000 /Thromb Res, 71, 417-422, 1993/ и 35700 /Blood, 74, 1577-1582, 1989/ соответственно.

Аббревиатуры для выражения состава дисахарида даются в табл. 2.

Настоящее изобретение будет объяснено подробнее посредством следующих далее ссылочного примера 4 и примеров.

Ссылочный пример 4
Определение Геп или ГС в DC
1/ Метод
Определение Геп или ГС в DC осуществляют с помощью следующих трех способов.

2/ Результаты
Результаты, полученные тремя вышеупомянутыми способами, приводятся в табл. 3,
Пример 1
Различия в продолжительности сохранения концентрации в крови RCDS, BIDS, RCDS-H(-) и BIDS-H(-) после введения исследуют на крысах.

2/ Результаты
Результаты выражают в виде относительного остаточного коэффициента (%) DC по отношению к его количеству при времени 0 /ноль/, как показано на фиг. 1. Остаточные коэффициенты RCDS и RCDS-H-(-) примерно в два раза выше, чем у BIDS и BIDS-H(-), через 5 минут после введения. RCDS и RCDS-H(-) показывают остаточные коэффициенты порядка 10% через 120 минут после введения, в то время как BIDS едва обнаруживается. RCDS-H(-) показывает несколько более высокий остаточный коэффициент, чем RCDS, через 5 и 120 минут после введения.

Пример 2
Исследуют противотромбозное действие DS на модели тромбоза в нижней полой вене у крыс.

1/ Материалы
Используют самцов крыс Sprague-Dawley /SD/ /Charles River Japan, Inc./ в возрасте 6,5-7,5 недель. В качестве DC используют RCDS и BIDS.

2/ Метод
Получение экспериментальной модели тромбоза
Модель тромбоза у крыс получают в соответствии со способом Reyers et al. [Thromb. Res., 18, 669-674 (1980)]. Для этого крысам производят лапаротомию под наркозом нембутала RTM /Dynabott-Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd./, и лигируют чуть ниже ответвления левой ренальной вены нижней полой вены хирургической шелковой нитью /N 7, диаметр 0,48-0,56 мм, Shinei Co., Ltd/. В хвостовую вену вводят испытуемые образцы RCDS и BIDS при дозах 1,3 и 10 мг/кг за 1 минуту до лигирования. Контрольной группе дают физиологический раствор. Крысам производят лапаротомию через 3 часа после лигирования, и иссекают вену, чтобы полностью извлечь тромб. Тромбы оставляют стоять в течение ночи при 37 o C, и замеряют их сухой вес. Полученные данные анализируют статистически по методу Newman-Keuls.

3/ Результаты
Результаты приводятся в табл. 3А. Относительный сухой вес тромбов у обеих групп с DC, которым введен 1 мг/кг, к весу тромбов в контрольной группе показывает степень ингибирования 60%. Однако вес тромбов в группе с RCDS снижается до 2,4% и 0,0% при дозах 3 и 10 мг/кг или более соответственно при сравнении с весом тромбов у контрольной группы, в то время как вес тромбов в группе с BIDS снижается только до 34,1% и 2,4% соответственно при сравнении с контрольной группой, что указывает на полезность RCDS.

Контрольная группа содержит 14 крыс, группы с DC содержат по 6 крыс, соответственно, и вычисляют средние величины.

Пример 3
Действие DC на образование тромбов и тромболиз исследуют на модели тромбоза в нижней полой вене у крыс.

1/ Материалы
Используют самцов крыс Sprague-Dawley /SD/ /Charles River Japan, Inc/ в возрасте 6,5-7,5 недель. В качестве DC используют RCDS и BIDS.

2/ Способ
1/ Получение экспериментальной модели тромбоза
Модель тромбоза получают путем лигирования нижней полой вены по способу, подобному способу в примере 2. Испытуемые образцы вводят в хвостовую вену при дозах 3, 10 и 30 мг/кг соответственно в виде 0,5 мл/кг. Контрольной группе вводят физиологический раствор. Крысам в контрольной группе через 6 часов после лигирования и в испытуемой группе через 2 часа после введения /8 часов после лигирования/ производят лапаротомию под эфирным наркозом, и отбирают кровь. Затем вены иссекают, тромбы полностью удаляют, и оставляют их стоять в течение ночи при 37 o C, чтобы определить их сухой вес. Полученные данные анализируют статистически по методу Newman-Keuls.

2/ Получение эуглобулиновой фракции
В пластиковую пробирку помещают 0,5 мл плазмы, и добавляют к ней 9,5 мл глубоко охлажденного 0,01N ацетатного буфера /pH 4,85/, все оставляют в холодильнике на 1 час, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, и получают эуглобулиновую фракцию. Осадки смешивают с 0,5 мл трис-HCl-буфера /pH 7,4/ и получают прозрачный раствор.

3/ Определение фибринолитической активности
В отверстие опытного фибрин-планшета помещают 10 мкл эуглобулиновой фракции, оставляют в инкубаторе при 37 o C в течение 18 часов, и измеряют фибринолитическую область /квадрат диаметра/. Фибринолитическая область пропорциональна силе активности плазмина. Полученные данные по фибринолизу анализируют по способу Newman-Keuls.

3/ Результаты
Результаты приводятся в табл. 4.

В табл. 4 «контроль, 6 час» относится к группе с лапаротомией под наркозом через 6 часов после лигирования вены, с последующим отбором крови и полным извлечением тромба. «Контроль, 8 час» относится к группе, которой вводили физиологический раствор через 6 часов после лигирования вены с последующим отбором крови и полным извлечением тромба спустя еще 2 часа.

1/ Влияние на образование тромбов и на тромболиз
Тромбы наблюдают во всех группах, но среди групп обнаруживают заметные различия, как показано в табл. 4. Группы, которые вводят как RCDS, так и BIDS, показывают зависящее от дозы снижение веса тромбов и по сравнению с группой «контроль, 8 час». Кроме того, группы, которым вводят 30 мг/кг BIDS и 10 мг/кг или более RCDS, демонстрируют меньший вес тромбов, чем в группе «Контроль, 6 час», что указывает не только на ингибирование тромбообразования, но также на тромболитическое действие. Другими словами, RCDS оказывает более сильное ингибирующее действие на тромбообразование и тромболитическое действие при меньших дозах, чем это наблюдается в группе с BIDS.

2/ Влияние на фибринолитическую систему
RCDS и BIDS вводят при дозах 3, 10 и 30 мг/кг соответственно и определяют активность плазмина в плазме через 2 часа /8 час после лигирования вены/. Результаты приводятся в табл. 4. Активность плазмина в группе, получившей 10 мг/кг RCDS, и в группе, получившей 30 мг/кг или более BIDS, оказывается существенно выше, чем в контрольной группе. Эти результаты указывают на превосходное действие RCDS.

Вес тромбов выражают в виде отношения, в %, к «Контроль, 8 час», вес в которой принимают за 100%. В группе «Контроль, 8 час» находится 16 крыс, а в других группах содержится по 8-9 крыс, соответственно, и для них вычисляют средние величины.

2/ Отдельные пункты испытаний
После введения эндотоксина отбирают кровь и удаляют почки, и проводят определения по перечисленным ниже пунктам.

1/ Количество тромбоцитов. Тромбоциты считают с помощью автоматического гемоцитометра /Cellac MEK-4500; Nippon Denko Co, Ltd /.

4/ Степень отложения ренального гломерулярного фибрина /% GFD/. Почки фиксируют 10% нейтральным буферным раствором формалина, заливают парафином, делают срез и окрашивают гематоксилином с фосфорновольфрамовой кислотой. Ренальные клубочки наблюдают под микроскопом по всему полю наблюдения образцов почек, и подсчитывают число отложений фибрина, и выражают его в виде процентного соотношения. Полученные результаты анализируют статистически по методу Newman-Keuls.

3/ Результаты
Результаты приводятся в табл. 5. Количество тромбоцитов, фибриноген и FDP составляют 7510 4 мкл, 216 мг/дл и 2,5 мкг/мл или менее соответственно, и не обнаруживается % GFD в случае обычной группы. Однако у крыс с индуцированной эндотоксином DIC обнаруживаются аномальные соответствующие коэффициенты 1410 4 мкл, 35 мг/дл, 34,3 мкг/мл и 61% соответственно.

Эксперимент осуществляют на 19 крысах в нормальной группе, 20 крысах в контрольной группе, и на 7 крысах в каждой из групп, которым вводят DS, и вычисляют средние значения.

Пример 6
1/ Материалы и метод
Исследуют влияние DC на фибринолитическую систему крысы.

Определяют количество DS в плазме и эуглобулиновой фракции /»New Biochemical Experiments», 3, Saccharide II pp. 175-179/. В контрольной группе используют физиологический раствор. Эти эксперименты выполняют в заранее установленное время, принимая во внимание циркадный ритм активности коагулирования и фибринолиза у крыс.

2/ Результаты
Полученные результаты приводятся в табл. 6 и 7.

DS показывает фибринолитическую активность до 12 часов после введения, как показано в табл. 6. Около 70-80% DS в плазме находятся в эуглобулиновой фракции, и проявляют фибринолитическую активность, как показано в табл. 7. RCDS также дает подобные результаты.

Как в контрольной группе, так и в группах с DS присутствует по 4-5 крыс, и вычисляют средние значения величин.

Как в контрольной группе, так и в группах с DS присутствует по 4-5 крыс, и вычисляют средние значения величин.

Пример 7
Исследуют стимулирующее действие DS на лизис сгустка плазмы человека.

1/ Метод
В 96-ячеечный планшет для микротитрования помещают по 40 мкл DS каждой из разных концентраций /BIDS/ /граничные концентрации 50,0-200 мкг/мл/, 20 мкл одноцепного t-PA /конечная концентрация 166,7 E/, 40 мкл тромбина /конечная концентрация 20 E/мл/ и 100 мкл плазмы человека и перемешивают. Сразу после приготовления определяют поглощение при 340 нм, и затем определяют поглощение каждые 10 минут, чтобы получить минимальное поглощение /мин/. Фибринолитическую активность выражают как отношение DS-PLTI/2//минуты/, полученное делением на 2 суммы максимального поглощения /макс/ и мин в присутствии DC к Cont-PLTI/2 контрольной группы.

2/ Результаты
Результаты приводятся в табл. 6. DC, в зависимости от дозы, стимулирует фибринолитическую активность сгустка плазмы, как показано на фиг. 6, RCDS дает подобные результаты.

Пример 8
Проверка токсичности дерматансульфатов при однократном внутривенном введении мышам
1/ Материалы и методы
Используют мышей Crj: CD-1 обоих полов /Charles River Japan, Inc./ в возрасте пяти недель. Готовят изотонические растворы RCDS-H(-) и BiDS-H(-) со стерильной дистиллированной водой и стерильным физиологическим раствором, и мышам в хвостовую вену, соответственно, однократно вводят 2000 мг/кг стеклянным шприцем. Животных наблюдают на предмет обнаружения признаков отравления в течение 14 дней.

2/ Результаты
Ни в одной из групп, которые получали DC, не наблюдают смертельных исходов даже при такой высокой дозе как 2000 мг/кг, как показано в табл. 8. Считается доказанным, что летальная доза в условиях настоящих испытаний превышает 2000 мг/кг.

Пример 9
Фармацевтические препараты
1/ В стерильном физиологическом растворе или в стерильной дистиллированной воде растворяют 500-5000 мг стерилизованной натриевой соли DS[RCDS или RCDS-H(-)] из петушиных гребней, полученных в соответствии со ссылочным примером 1, и получают изотонические растворы, объемы которых доводят до 100 мл. Растворы разливают в 10-мл ампулы, и получают препараты для интраваскулярной, подкожной или внутримышечной инъекции.

2/ Упаковывают раздельно 250 мг натриевой соли DC [RCDS или RCDS-H(-)], полученных из куриных гребней в соответствии со ссылочным примером 1, и 1.000.000 ME t-PA, и получают препараты для инъекций, из которых готовят раствор непосредственно перед использованием. Такие препараты для инъекций применяют для интра-коронарноартериальной или внутривенной инъекции.

Промышленное применение
Дерматансульфаты или их фармацевтически приемлемые соли стимулируют фибринолитическую активность и могут применяться для тромболитических стимуляторов.

Кроме того, совместное применение дерматансульфатов, в том числе их натриевых солей, с тканевыми плазминогенными активаторами /t-PA/ заметно увеличивает тромболитическое действие и может снизить дозу t-PA.

Кроме того, специфические дерматансульфаты настоящего изобретения, т.е. дерматансульфаты, имеющие характеристическую вязкость 0,8 (100 мл/г) или выше, полученные из петушиных гребней, содержащие 2-7% Di-OS в своем составляющем дисахариде, имеющие среднюю молекулярную массу 25000-100000 дальтон, определяемую гель-фильтрацией в соответствии со способом в Biochem. Biophys. Acta, 1117, 60-70 (1992), или упомянутые выше специфические дерматансульфаты, содержащие очень небольшое количество гепарина или гепаран сульфата, или их фармацевтически приемлемые соли, сохраняют свою эффективную концентрацию в крови в течение длительного времени и предупреждают развитие тромбоза, ингибируют развитие тромбов и т.д.

Следовательно, противотромбозные средства настоящего изобретения также пригодны для лечения и предупреждения инфаркта миокарда, синдрома рассеянной интраваскулярной коагуляции /DIC/, нарушений во многих органах, сопровождающих множественный тромбоз, глубокого тромбоза вен и т.д. Кроме того, эти средства могут быть показаны для предупреждения свертывания крови при искусственном кровообращении, таком как при гемодиализе для пациентов, страдающих от почечной недостаточности, и т.д. Кроме того, DC обладают меньшим побочным действием, таким как кровотечение и т.п., по сравнению с побочным действием гепарина. DS-H(-), подменный удалением Геп и ГС из DC, обладает повышенной безопасностью одновременно с гораздо меньшими побочными реакциями, такими как кровотечение и т.п. Таким образом, полученный в результате продукт может быть предпочтительно показан пациентам с тенденцией к кровотечениям или с риском по тромбоцитам и факторам коагуляции.

1. Дерматансульфат или его соль, имеющий характеристическую вязкость 0,8(100 мл/г) или выше при определении вискозиметром Уббелоде с применение в качестве растворителя 0,2 M раствора хлорида натрия при температуре 30 0,1 o С при этом указанный дерматансульфат содержит 0,15% или менее гепарина или гепаран сульфата при определении способом, включающим обработку ферментами расщепления гепарина или гепаран сульфата и жидкостную хроматографию высокого разрешения, 0,07% или менее гепарина или гепаран сульфата, определяемого по ингибирующему действию активного фактора X в присутствии антитромбина III с применением гепарина, выделенного из коровьих кишок в качестве стандартного вещества, или 0,05% или менее гепарина или гепаран сульфата, определяемого по ингибирующему действию активного фактора II в присутствии антитромбина III при использовании в качестве стандартного вещества гепарина, выделенного из коровьих кишок.

3. Дерматансульфат или его соль по п.1 или 2, отличающийся тем, что дерматансульфат выделен из курьих гребней.

4. Дерматансульфат или его соль по п.1, отличающийся тем, что дерматансульфат или его соль содержит 2-7% (2-ацетамидо-2-деокси-3-0-4-деокси--трео-гекс- L-4-эндопиранозилуроновой кислоты)-D-галактозы (Di-OS) в составляющих дисахаридах при определении методом, включающим ферментативное расщепление и жидкостную хроматографию высокого разрешения.

6. Противотромбозное средство, содержащее в качестве активного ингредиента дерматансульфат или его фармацевтически приемлемую соль в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемым адъювантом, отличающееся тем, что в качестве активного ингредиента содержит дерматансульфат или его соль по любому из предшествующих пунктов в эффективного количестве.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что объектами введения являются пациенты с возможным или развивающимся тромбозом или пациенты с тромбозом вследствие склонности к кровотечениям, вызванной пониженным количеством тромбоцитов или пониженными факторами коагуляции.

10. Противотромбозные средства, содержащие эффективные количества тканевого плазминогенного активатора (t-PA) и дерматансульфат или его фармакологически приемлемую соль в сочетании с фармацевтически приемлемым адъювантом.

11. Противотромбозные средства по п.10, отличающиеся тем, что дерматансульфат или его фармакологически приемлемую соль выделяют из куриных гребней.

17. Способ лечения инфаркта миокарда, отличающийся тем, что пациентам с инфарктом миокарда вводят фармацевтическую лекарственную форму, включающую тканевый плазминогенный активатор (t-PA) и дерматансульфат или его фармакологически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым адъювантом.

Источник