Для чего добавляется индикатор в углеводные среды пестрого ряда

Биохимические методы идентификации бактерий. Способность к ферментации углеводов у бактерий. Пёстрый ряд при диагностике бактерий. Расщепление белков бактериями.

Методов, используемых для идентификации особенностей метаболизма бактерий, очень много, но на практике применяют небольшое их количество. Большинство способов основано на использовании дифференциально-диагностических сред, включающих различные индикаторы.

Способность к ферментации углеводов у бактерий

Способность к ферментации углеводов у бактерий оценивают по изменению окраски среды вследствие образования органических кислот (соответственно, происходит уменьшение рН), вызывающих изменение окраски индикатора.

Стеклянные поплавки при диагностике ферментации углеводов у бактерий

Для определения сахаролитической активности применяют среды Хисса; в их состав входят 1% пептонная вода (или МПБ), индикатор Андраде и один из углеводов. При расщеплении углевода происходит изменение цвета среды с жёлтого на красный. Поскольку бактерии различают по способности ферментировать те или иные углеводы, то ряды пробирок приобретают пёстрый вид. Поэтому этот набор сред и называют «пёстрый» (или цветной) ряд.

Стеклянные поплавки при диагностике ферментации углеводов у бактерий. Для определения способности микроорганизмов ферментировать углеводы с образованием кислоты и газа в сосуды со средами вносят стеклянные поплавки (запаянные с одного конца короткие трубочки), всплывающие после наполнения их газом.

Расщепление белков бактериями

Некоторые бактерии проявляют протеолитическую активность, выделяя протеазы, катализирующие расщепление белков. Наличие протеолитических ферментов из группы коллагеназ определяют при посеве уколом в МПЖ. При положительном результате наблюдают его разжижение в виде воронки либо послойно сверху вниз. Способность к расщеплению белков и аминокислот также можно оценивать по изменению окраски среды, так как образующиеся продукты — аммиак, индол и сероводород — сдвигают рН в щелочную сторону, вызывая изменение окраски индикатора.

Образование аммиака бактериями. Для определения способности к образованию NH3 проводят посев в МПБ, и между его поверхностью и пробкой закрепляют полоску лакмусовой бумаги. При положительном результате бумажка синеет. Образование индола и H2S. Обычно для определения способности к образованию индола и сероводорода также проводят посев в МПБ, между его поверхностью и пробкой закрепляют бумажки: в первом случае пропитанные раствором щавелевой кислоты (при образовании индола бумажка краснеет), во втором — раствором ацетата свинца (при образовании H2S бумажка чернеет). Также используют специальные среды, содержащие индикаторы (например, среда Клиглера), либо их вносят непосредственно в среду после регистрации видимого роста бактерий (см. также рис. 18-2, А).

Источник

2. Методы идентификации грам (-) бактерий.

2.3. Ферментация углеводов (“пестрый ряд”).

Принцип. Способность ферментировать углеводы до образования кислых метаболитов варьирует у разных бактерий, что позволяет проводить их дифференциацию и идентификацию. Специфические углеводы добавляют к основной среде, содержащей химический индикатор, который изменяет цвет среды под действием кислоты, образующейся при ферментации углевода.

Среды и реагенты. Можно использовать коммерческие среды с углеводами или готовить их самостоятельно, используя разные модификации.

1. Основной бульон с феноловым красным:

мясной экстракт (необязательно) 1 г

феноловый красный (индикатор) 0,018 г

дистиллированная вода 1000 мл

Þ Растворяют ингредиенты в дистиллированной воде при осторожном подогревании (если это необходимо).

Þ Автоклавируют при 121 ° 15 мин.

Þ Остужают до 45-50 ° C в водяной бане.

Þ К кратным объемам основного бульона по отдельности добавляют углеводы, стерилизованные фильтрованием, до конечной концентрации 0,5-1%.

Þ Разливают по 4-5 мл в стерильные пробирки, куда можно поместить стерильные “поплавки” (перевернутые вверх дном пробирки Durham ) для определения газообразования.

2. Модифицированный индикатор Андреде :

кислый фуксин 0,5 г

дистиллированная вода 100 мл

Þ Растворяют фуксин в воде и добавляют 15 мл NaOH (когда через несколько часов красный цвет изменится на коричневый, добавляют по каплям щелочь пока не установится необходимый соломенно-желтый цвет).

Þ Автоклавируют при 115 ° C 20 мин.

Þ Остужают и добавляют по отдельности углеводы (см. п.1), разливают по 4-5 мл в пробирки и маркируют их.

Þ Срок годности 3 мес. при хранении в холодильнике (2-8 ° C ).

Þ Изменение цвета среды свидетельствует о ее непригодности.

3. Полужидкая основная среда с феноловым красным.

Þ К основному бульону с феноловым красным добавляют 0,4-0,6% агара. Конечная pH 7,5.

Þ Помещают емкость с агаровой смесью на магнитную мешалку с подогревом и встряхивают при осторожном нагревании до полного растворения агара.

Þ Разливают по 4-5 мл в пробирки и автоклавируют при 121 ° C 15 мин.

Þ Маркируют и хранят в холодильнике не более 3 мес.

4. Цистин-триптиказовый агар:

натрия сульфит ( ) 0,5 г

феноловый красный (индикатор) 0,017 г

дистиллированная вода 1000 мл

Этапы приготовления среды аналогичны изложенным выше (п.3)

Можно использовать готовый сухой цистин-триптиказовый агар (4,3г растворяют в 1 л дистиллированной воды).

5. Приготовление основных (20%) растворов углеводов :

Þ Добавляют 20 г углевода к 100 мл дистиллированной воды.

Þ Стерилизуют фильтрацией через милипоровые фильтры (диаметр пор 0,2 мкм) или дробно стерилизуют текучим паром.

Þ Растворы стабильны 2-3 мес при хранении в холодильнике (2-8 ° C ).

Þ Для приготовления рабочей концентрации углевода добавляют 0,25 мл 20% основного раствора в пробирку с 5 мл основной среды.

Контроль качества осуществляют с эталонными культурами Klebsiella pneumoniae АТСС 13883 и Proteus mirabilis АТСС 29245 (соответственно, положительный и отрицательный контроль для адонита, арабинозы, сорбита), Stenotrophomonas cepacia АТСС 17765 и Pseudomonas putrifaciens АТСС 8071 (соответственно, положительный и отрицательный контроль для глюкозы, лактозы, мальтозы, маннита, сахарозы, ксилозы).

Посев в жидкую среду.

Þ При использовании тампона окунают его в бульон с чистой культурой; при взятии культуры с агаровой среды тампон предварительно смачивают в физиологическом растворе или бульоне. Отжимают тампон о стенку пробирки, не касаясь углеводной среды, и наклоняют пробирку так, чтобы инокулят достиг среды.

Þ При использовании стерильной иглы, петли или деревянной палочки забирают колонии чистой культуры и погружают их в каждую пробирку с углеводной средой.

Посев в полужидкий агар.

Þ Стерильной иглой или деревянной палочкой берут колонию чистой культуры и производят посев путем прокола среды по центру на 3/4 ее глубины. Не рекомендуется использовать для посева петлю, так как это может сопровождаться ложным эффектом газообразования.

* Для короткого “ пестрого ряда” из 8-10 углеводов обычно достаточно одного инокулята. Если используются 15-20 сахаров, может понадобиться дополнительное взятие культуры для посева; при этом либо используют новый тампон, либо заново простерилизованную иглу или петлю.

* Нет необходимости в прожигании петли или иглы между посевами, поскольку перенос углеводов из одной пробирки в другую настолько незначителен, что это не отражается на конечном результате.

Þ Засеянные жидкие или полужидкие углеводные среды инкубируют при 35 ° C 18-24 ч; для некоторых микроорганизмов необходима более длительная инкубация.

Þ При положительной реакции с индикатором феноловым красным среда окрашивается в желтый цвет за счет образования кислоты; при отрицательной реакции среда защелачивается и остается красно-розового цвета.

Þ При положительной реакции с индикатором Андреде среда окрашивается в красно-розовый цвет; при отрицательной реакции цвет среды варьирует от желтого до бесцветного.

Ограничения и предосторожности.

1) Для контроля роста необходимо производить посев культуры в основную среду без углевода.

2) Если микроорганизмы не растут на основной среде, в каждую углеводную среду добавляют либо сыворотку, либо дрожжевой экстракт. При добавлении сыворотки ее предварительно инактивируют при 60 ° C в течение 1часа.

3) Концентрация углеводов в среде должна составлять 1% (салицина – 0,5%), что предотвращает обратное развитие (реверсию) реакции.

4) Если используют “поплавки”, достаточно ограничиться одним, поместив его в пробирку с глюкозой.

5) Перед посевом необходимо тщательно исследовать “поплавок” на наличие газа, так как любой, самый маленький пузырек газа расценивается как показатель газообразования.

6) “Поплавки” не применяются в полужидких средах, где образование газа проявляется разрывами среды, образованием пузырей или отделением среды от дна пробирки.

Источник

Пестрый ряд микробиология

Дифференциально-диагностические среды

Фуксинсульфитный агар (среда Эндо)

В мясопептонный бульон добавляют 3-4% агара, доводят pH до 7,6, разливают в склянки по 100 мл и стерилизуют, как обычно, в автоклаве, сохраняя в таком виде до момента приготовления фуксинсульфитного агара. Готовят фуксинсульфитный агар в день использования. Заготовлять впрок и хранить эту среду нельзя, так как она быстро краснеет.

К 100 мл расплавленного и охлажденного до 70°С 3-4%-ного мясопептонного агара стерильно добавляют 1 г лактозы, предварительно растворив и прокипятив ее в 5 мл стерильной воды. Кроме того, сюда же добавляют 0,5 мл профильтрованного насыщенного спиртового раствора основного фуксина и 2,5 мл свежеприготовленного 10%-ного раствора сернистокислого натра. Сернистокислый натр (Na2SO3) в количестве 0,5 г растворяют в 5 мл воды и перед употреблением стерилизуют кипячением.

Можно поступить и несколько иначе. Фуксин и сульфит натрия сначала смешивают в пробирке: к 0,5 мл раствора фуксина прибавляют при встряхивании раствор сульфита натрия до тех пор, пока жидкость в пробирке не станет бесцветной или слегка розовой. И в расплавленный и несколько охлажденный агар вливают уже эту смесь. Колбу со средой тщательно встряхивают для перемешивания и среду разливают в чашки Петри. После застывания среды ее подсушивают в термостате при 37 °С в течение 30 мин.

В горячем состоянии среда должна быть слабо-розового цвета, а после остывания совершенно бесцветной. Обесцвечивание фуксина в среде Эндо вызывает введенный сернистокислый натр.

Среда Симмонса

При идентификации микробов группы коли (чтобы отличить почвенный вид Escherichia coli aёrogenes от фекального вида Escherichia coli commune) применяется цитратная среда Симмонса. В 1 л дистиллированной воды растворяют 1,5 г фосфорнокислого натра (или однозамещенного фосфорнокислого аммония), 1 г однозамещенного фосфорнокислого калия (КН2РO4), 0,2 г сернокислого магния, 2,5-3 г кристаллического лимоннокислого натрия, устанавливают pH 7,0-7,2, добавляют 2% агара и, расплавив среду, разливают ее в колбы по 100 мл. Стерилизуют в автоклаве 15 мин при 120°С.

Перед употреблением в среду необходимо добавить индикатор. Можно использовать либо бромтимолблау, либо фенолрот. Индикатор добавляют к 100 мл расплавленной среды. Бромтимолблау берут в количестве 1 мл спиртового 1,5%-ного раствора. Среда приобретает оливково-зеленый цвет. Фенолрот добавляется в количестве 2 мл 1,5%-ного спиртового раствора. Среда окрашивается в желтый цвет. После добавления индикатора среду разливают в пробирки и стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 15 мин.

Пестрый ряд углеводов, или среды Гисса

Для определения ферментативной способности микроорганизмов пользуются средами Гисса. В зависимости от наличия в микробной клетке того или иного фермента она способна разлагать какой-либо один из углеводов с образованием определенных продуктов разложения, поэтому в состав среды вводится какой-либо углевод: лактоза, глюкоза, маннит, сахароза и пр. Набор таких сред получил название «пестрого ряда углеводов».

Сначала готовят пептонную воду: на 1 л дистиллированной воды берут 10 г пептона и 5 г химически чистой поваренной соли, кипятят до растворения пептона, фильтруют через бумажный фильтр (фильтрат должен быть совершенно прозрачным) и устанавливают pH 7,2-7,4. Затем к 100 мл пептонной воды добавляют по 0,5 г одного из применяемых углеводов и по 1 мл индикатора Андреде.

В состав индикатора Андреде входит: 0,5 г кислого фуксина, 16 мл 1 н. раствора едкого натра (NaOH) и 100 мл дистиллированной воды. При необходимости индикатор можно готовить заранее и сохранять его в темном месте, предварительно про-кипятив при 100 °С в течение 15 мин. После введения индикатора среды разливают по пробиркам с поплавками и стерилизуют в кипятильнике Коха трижды по 30 мин. По окончании стерилизации поплавки должны быть погружены в среду, в противном случае пробирка не может быть использована. Среды Гисса с реактивом Андреде имеют соломенно-желтый цвет без розового оттенка. При развитии в среде микроорганизмов последние, разлагая сахар с образованием кислоты, вызывают изменение реакции. А так как в кислой среде индикатор Андреде краснеет, то это и является свидетельством, что микроорганизм использует данный сахар для своей жизнедеятельности. Отсутствие покраснения, наоборот, свидетельствует об отсутствии в ферментативном комплексе изучаемого микроба фермента, разлагающего имеющийся в среде углевод.

Ферментативная активность микроорганизмов богата и разнообразна. Она позволяет установить видовую и типовую принадлежность, определить биологические варианты микроба. Существует целый ряд ферментов, по активности которых можно определить степень патогенности микроорганизма.

Для определения ферментативной (биохимической) активности микробов используют дифференциально – диагностические среды.

К дифференциально – диагностическим средам относятся среды Гисса, на которых изучается сахаролитическая активность микрооганизмов.

Среды Гисса могут быть жидкими и плотными. Основу сред Гисса составляют мясо – пептонный бульон (МПБ) и мясо – пептонный агар (МПА). В состав этих сред входит углевод и индикатор. Существуют два ряда сред Гисса – большой (включающий 27 наименований) и малый. Малый ряд сред Гисса включает мальтозу, глюкозу, сахарозу, манит и лактозу. Исходная установка рН среды – слабо щелочная (7,2 – 7,4).

Если при культивировании микробов происходит расщепление субстрата до кислоты, то рН среды изменяется в кислую сторону и при этом происходит изменение цвета индикатора. Изменение цвета питательной среды и является показателем наличия у данного микроба фермента, расщепляющего конкретный субстрат до кислоты. И в жидкой, и в плотной питательной среде о наличии фермента, расщепляющего субстрат до кислоты, судят по изменению цвета индикатора.

Образование газа устанавливают по скоплению пузырьков газа в толще агара и по разрыву агара (если среды Гиса плотные) или по скоплению пузырьков газа в поплавке (если среды жидкие). Поплавок – узкая стеклянная трубочка с запаянным концом, обращенным вверх, которую помещают в пробирку со средой перед стерилизацией среды.

Различие в наборе ферментов, расщепляющих углеводы, может быть использовано при дифференцировке родственных микробов, например, сальмонелл, шигелл, эшерихий. Так, на средах Эндо, Левина, Плоскирева, в состав которых входит лактоза и индикатор (анилиновый краситель), колонии кишечной палочки будут окрашены в фиолетовый цвет (на среде Левина) или в сиреневый (на средах Эндо и Плоскирева). Колонии сальмонелл и шигелл на этих же средах будут бесцветными.

Это обусловлено тем, что кишечная палочка, имея фермент лактазу, расщепляет лактозу, в результате чего образуется кислота, рН среды смещается в кислую сторону и происходит проявление цвета индикатора – анилинового красителя. Особи кишечной палочки хорошо окрашиваются анилиновым красителем, а совокупность окрашенных особей представляет окрашенную колонию.

Шигеллы и сальмонеллы не имеют фермента лактазы и не расщепляют лактозу, рН среды не изменяется, индикатор не проявляется, микробные клетки не окрашиваются. Поэтому колонии сальмонелл и шигелл на средах Эндо и Плоскирева будут бесцветными.

О наличии фермента амилазы можно судить, посеяв культуру на среду, содержащую крахмал. Если есть фермент, расщепляющий крахмал, то при добавлении в пробирку капли раствора Люголя, посинение среды не произойдет. Нерасщепленный крахмал при добавлении раствора Люголя дает синее окрашивание.

Протеолитические свойства (т.е. способность расщеплять белки, полипептиды и пр.) изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При росте на желатиновой среде микробов, ферментирующих желатин, среда разжижается. Характер разжижения, вызываемый разными микробами, различен.

При расщеплении пептоном могут выделяться индол, скатол, сероводород, аммиак. Их образование устанавливают с помощью индикаторов. Например, фильтровальную бумагу заранее пропитывают раствором индикатора, высушивают, нарезают узенькими полосками длиной 5 – 6 см и после посева культуры на МПБ помещают под пробку (между пробкой и стенкой пробирки). После инкубации в термостате учитываю результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной 20% раствором ацетата свинца и гидрокарбоната натрия, происходит образование сульфата свинца – соли черного цвета, и индикаторная бумажка чернеет. Индол способствует покраснению бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты.

Гемолитические свойства микробов можно выявить, используя кровяной агар. Если микроб имеет фермент гемолизин, то вокруг колоний этого микроба будут зоны лизиса эритроцитов ( в этих зонах агар будет бесцветным).

Фермент лецитиназу выявляют при посеве культуры на желточно – солевой агар. Вокруг колонии микроба, продуцирующего этот фермент, образуется матовый ореол.

Следует помнить о том, что наличие различных ферментов определяет биохимические свойства микробов.

Культуральные и биохимические свойства возбудителей пищевых токсикоинфекции

Ферментный состав любого микроорганизма является достаточно постоянным признаком в нормальных условиях, т.е. различные виды микроорганизмов различаются по набору ферментов.

Изучение ферментного состава имеет важное значение для дифференцировки и идентификации различных микроорганизмов.

Специальные методы окраски бактерий. Наибольшее распространение нашли методы Грама и Циля-Нильсена.

Дифференцирующие методы обычно применяют для окрашивания различных морфологических структур.

Капсулы. Для окраски капсул бактерий применяют методы Хисса, Лейфсона и Антони; последний метод наиболее прост и включает окраску кристаллическим фиолетовым с последующей обработкой 20% водным раствором CuSO4.

Жгутики. Для окраски жгутиков предложены методы Лёффлера, Бейли, Грея и др. Для этих методов характерны первоначальное протравливание препарата и последующая окраска (чаще карболовый фуксин Циля).

Споры. Окраску спор бактерий проводят после предварительной обработки их стенок. Наиболее прост метод Пешкова, включающий кипячение мазка с синькой Лёффлера на предметном стекле с последующей докраской нейтральным красным. Споры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки — в розовый.

При выращивании бактерий применяют стационарный способ, способ глубинного культивирования с аэрацией и метод проточных питательных сред. В соответствии со способами выращивания бактериальные культуры разделяют на периодические (при стационарном и глубинном культивировании) и непрерывные (при проточном культивировании).

Стационарный способ — наиболее часто используемый на практике. Состав сред остаётся постоянным, с ними не проводят никаких дополнительных манипуляций.

Способ глубинного культивирования применяют при промышленном выращивании бактериальной биомассы, для чего используют специальные котлы-реакторы. Они снабжены системами поддержания температуры, подачи в бульон различных питательных веществ, перемешивания биомассы и постоянной подачи кислорода. Создание аэробных условий по всей толще среды способствует протеканию энергетических процессов по аэробному пути, что способствует максимальной утилизации энергетического потенциала глюкозы и, следовательно, максимальному выходу биомассы.

Метод проточных сред (промышленный способ культивирования) позволяет постоянно поддерживать бактериальную культуру в экспоненциальной фазе роста, что достигают постоянным внесением питательных веществ и удалением определённого числа бактериальных клеток. Пребывание бактерий в экспоненциальной стадии роста обеспечивает максимальный выход различных БАВ (витамины, антибиотики и др.).

Первичная идентификация бактерий

В большинстве случаев изучение особенностей роста для первичной идентификации возбудителей проводят на колониях, выросших в течение 18-24 ч. Характер роста бактерий на различных средах может дать много полезной информации. На практике используют сравнительно небольшой набор критериев. В жидких средах обычно учитывают характер поверхностного (образование плёнки) или придонного роста (вид осадка) и общее помутнение среды. На твёрдых средах бактерии формируют колонии — изолированные структуры, образующиеся в ре зультате роста и накопления бактерий. Колонии возникают как следствие роста и размножения одной или нескольких клеток. Таким образом, пересев из колонии в дальнейшем даёт возможность оперировать с чистой культурой возбудителя. Рост бактерий на плотных средах имеет больше характерных особенностей.

Некоторые бактерии выделяют гемолизины — вещества, разрушающие эритроциты. На КА их колонии окружают зоны просветления. Образование гемолизинов (и соответственно — размеры зон гемолиза) может быть вариабельным, и для адекватного определения гемолитической активности следует просматривать чашки с посевами против источника света (рис. 1-14). Активность гемолизинов может проявляться в полном или неполном разрушении эритроцитов.

α-Гемолиз. Разрушение эритроцитов может быть неполным, с сохранением клеточной стромы. Подобный феномен называют α-гемолиз. Просветление среды вокруг колоний обычно незначительно, позднее среда вокруг колоний может приобретать зеленоватую окраску.

В бактериологической практике чаще всего изучают сахаролитические и протеолитические ферменты

Подобный рост характерен для пневмококка, а также для группы так называемых зеленящих стрептококков.

β-Гемолиз. Гораздо большая группа бактерий вызывает полное разрушение эритроцитов, или β-гемолиз. Их колонии окружены прозрачными зонами различного размера. Например, Streptococcus pyogenes и Staphylococcus aureus образуют большие зоны гемолиза, a Listeria monocytogenes или Streptococcus agalactiae — небольшие, диффузные зоны. Для определения гемолитической активности не следует применять шоколадный агар (ША), так как образующиеся зоны α- или β-гемолиза не имеют характерных особенностей и вызывают одинаковое позеленение среды.

Размеры и форма колоний

Важные признаки колоний — их размеры и форма. Колонии могут быть большими или мелкими. Величина колоний — признак, позволяющий различать различные виды, роды и даже типы бактерий.

В большинстве случаев колонии грамположительных бактерий мельче колоний грамотрицательных бактерий. Колонии бактерий могут быть плоскими, приподнятыми, выпуклыми, иметь вдавленный или приподнятый центр. Другой важный признак — форма краёв колоний. При изучении формы колоний учитывают характер её поверхности: матовый, блестящий, гладкий или шероховатый. Края колоний могут быть ровными, волнистыми, дольчатыми (глубоко изрезанными), зубчатыми, эрозированными, бахромчатыми и т.д. Размеры и формы колоний часто могут изменяться. Подобные изменения известны как диссоциации. Наиболее часто обнаруживают S — и R — duc социации. S-колонии круглые, гладкие и выпуклые, с ровными краями и блестящей поверхностью. R-колонии — неправильной формы, шероховатые, с зубчатыми краями.

При просмотре посевов также обращают внимание на цвет колоний. Чаще они бесцветные, белые, голубоватые, жёлтые или бежевые; реже — красные, фиолетовые, зелёные или чёрные. Иногда колонии ирризируют, то есть переливаются всеми цветами радуги. Окрашивание возникает в результате способности бактерий к пигментообразованию. На специальных дифференцирующих средах, включающих специальные ингредиенты или красители, колонии могут приобретать разнообразную окраску (чёрную, синюю и др.) за счёт включения красителей либо их восстановления из бесцветной формы. В данном случае их окраска не связана с образованием каких-либо пигментов.

Консистенция колоний и особенности роста на среде

Полезную информацию могут дать консистенция колоний и особенности роста на среде. Обычно эту информацию можно получить при прикосновении к колониям петлёй. Колонии могут легко сниматься со среды, врастать в неё или вызывать её коррозию (образуя трещины и неровности). Консистенция колоний может быть твёрдой или мягкой.Мягкие колонии — маслянистые или сливкообразные; могут быть слизистыми (прилипают к петле) или низкими (тянущимися за петлёй).

Твёрдые колонии — сухие, восковидные, волокнистые или крошковатые; могут быть хрупкими и ломаться при прикосновении петлёй.

Запах — менее важный признак колоний, поскольку вызываемые им ассоциации носят субъективный характер. В частности, культуры синегнойной палочки имеют запах карамели, культуры листерий — молочной сыворотки, протеев — гнилостный запах, нокардий — свежевскопанной земли.

Биохимические методы идентификации бактерий

Методов, используемых для идентификации особенностей метаболизма бактерий, очень много, но на практике применяют небольшое их количество. Большинство способов основано на использовании дифференциально-диагностических сред, включающих различные индикаторы.

Способность к ферментации углеводов

Способность к ферментации углеводов оценивают по изменению окраски среды вследствие образования органических кислот (соответственно, происходит уменьшение рН), вызывающих изменение окраски индикатора.

«Пёстрый» ряд. Для определения сахаролитической активности применяют среды Хисса; в их состав входят 1% пептонная вода (или МПБ), индикатор Андраде и один из углеводов. При расщеплении углевода происходит изменение цвета среды с жёлтого на красный. Поскольку бактерии различают по способности ферментировать те или иные углеводы, то ряды пробирок приобретают пёстрый вид. Поэтому этот набор сред и называют «пёстрый» (или цветной) ряд.

Стеклянные поплавки. Для определения способности микроорганизмов ферментировать углеводы с образованием кислоты и газа в сосуды со средами вносят стеклянные поплавки (запаянные с одного конца короткие трубочки), всплывающие после наполнения их газом.

Некоторые бактерии проявляют протеолитическую активность, выделяя протеазы, катализирующие расщепление белков. Наличие протеолитических ферментов из группы коллагеназ определяют при посеве уколом в МПЖ. При положительном результате наблюдают его разжижение в виде воронки либо послойно сверху вниз. Способность к расщеплению белков и аминокислот также можно оценивать по изменению окраски среды, так как образующиеся продукты — аммиак, индол и сероводород — сдвигают рН в щелочную сторону, вызывая изменение окраски индикатора.

Образование аммиака. Для определения способности к образованию NH3 проводят посев в МПБ, и между его поверхностью и пробкой закрепляют полоску лакмусовой бумаги. При положительном результате бумажка синеет.

Образование индола и H2S. Обычно для определения способности к образованию индола и сероводорода также проводят посев в МПБ, между его поверхностью и пробкой закрепляют бумажки: в первом случае пропитанные раствором щавелевой кислоты (при образовании индола бумажка краснеет),во втором — раствором ацетата свинца (при образовании H 2 S бумажка чернеет).Также используют специальные среды, содержащие индикаторы (например, среда Клиглера), либо их вносят непосредственно в среду после регистрации видимого роста бактерий.

Тест на нитратредуктазную активность

Этот тест используют для идентификации отдельных видов бактерий. Он позволяет определить способность восстанавливать нитраты в нитриты. Способность к восстановлению NO3 в N02, определяют культивированием в МПБ, содержащем 1% раствор KNO3. Для определения нитритов в среду добавляют несколько капель реактива Грисса. При положительном результате наблюдают появление красного кольца.

Хроматографические методы используют для идентификации бактерий и установления их систематического положения. Объекты для исследования — жирные кислоты клеточной стенки, уникальные интермедиаты и конечные метаболиты жизнедеятельности бактерий. Хроматографические системы обычно сопрягают с компьютерами, что значительно упрощает учёт результатов. Наиболее распространена идентификация жирных короткоцепочечных и тейхоевых кислот методом газожидкостной хроматографии. Жидкостной хроматографией под высоким давлением идентифицируют миколевую кислоту в клеточных стенках микобактерий. Тонкослойную хроматографию используют для идентификации изопреноидных хинонов клеточной стенки бактерий. У различных родов их содержание и набор различны, но постоянны, что позволяет установить систематическое положение каждого конкретного вида.

Для изучения биохимической активности бактерий широко применяют системы индикаторных бумажек или наборы мультимикротестов.

Система индикаторных бумажек (СИБ) — набор дисков, пропитанных различными субстратами. Их можно непосредственно вносить в пробирки со взвесью бактерий либо предварительно поместить в лунки пластиковых планшетов, куда будут внесены исследуемые бактерии. Так, на практике применяют наборы Minitek Enterobacteriaceaelll и Minitek Neisseria для дифференциальной диагностики энтеробактерий (четырнадцать субстратов) и нейссерий (четыре субстрата), позволяющие получить результаты через 4 ч инкубации при 37 °С.

Наборы мультимикротестов — пластиковые планшеты, в лунки которых помещены различные субстраты и индикаторы. В лунки вносят различные разведения бактерий и инкубируют при 37 °С. На практике используют тесты RapID NH для идентификации нейссерий и гемофилов, RapID Е для энтеробактерий и др., позволяющие получить результаты не позднее 4-8 ч.

Автоматические системы идентификации бактерий

Автоматические системы идентификации бактерий позволяют быстро (на 24-48 ч быстрее обычных методов) получить информацию о виде возбудителя заболевания и его чувствительности к антимикробным препаратам. В настоящее время наибольшее распространение получили системы типа Microscan и Vitek.

Системы Microscan. Используют турбидиметрические, колориметрические и флюоресцентные методы идентификации бактерий. Системы состоят из комплектов пластиковых планшетов, содержащих различные субстраты. Грамположительные и грамотрицательные бактерии дифференцируют с помощью флюоресцирующих субстратов (время анализа — 2 ч). Для идентификации гемофилов, анаэробов и дрожжей используют хромогенные субстраты, изменяющие свою окраску (время анализа — 4-6 ч). Минимальные ингибирующие концентрации различных антибиотиков определяют по изменению оптической плотности. Система компьютеризирована и автоматически проводит все необходимые расчёты.
Системы Vitek. В этой системе применяют один тип планшетов с тридцатью лунками. В каждую лунку автоматически вносится суспензия бактерий с известной концентрацией микробных тел. Идентификация микроорганизмов (гемофилы, нейссерии, дрожжи и анаэробы) основана на турбидометрии реакционной среды в лунке. В зависимости от свойств микроорганизма время, необходимое для его идентификации, варьирует от 4-8 до 18 ч. Система полностью компьютеризирована и работает автоматически.

Методы идентификации нуклеиновых кислот

Методы выявления РНК и ДНК возбудителей нашли применение в основном при диагностике вирусных инфекций. Тем не менее разработаны тест-системы для идентификации некоторых прихотливых бактерий (например, легионелл, хламидий), а также для идентификации колоний Neisseha gonorrhoeae, Haemophilus influenzae типа b, стрептококков группы В, энтерококков и микобактерий.

Гибридизация нуклеиновых кислот

Наиболее распространены методы гибридизации нуклеиновых кислот. Принцип методов обусловлен способностью ДНК (и РНК) специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (и РНК), меченных изотопами или ферментами (пероксидазой или щелочной фосфатазой). В дальнейшем образцы исследуют различными методами (например, ИФА).

Метод гибридизации в растворах даёт наиболее быстрые результаты. Широкому внедрению метода препятствует проблема удаления не связавшихся нитей нуклеиновых кислот.

Метод гибридизации на твёрдой основе и его сэндвич- модификация распространён больше. В качестве твёрдой основы служат мембраны из нитроцеллюлозы или нейлона. Не связавшиеся реагенты удаляют многократным отмыванием.

Биохимическая идентификация бактерий с помощью тест-систем

Другие варианты подобных тест-систем предусматривают адсорбцию дифференцирующих субстратов на бумажных или полимерных носителях. Среди них распространены системы Auxtab, Minitek, Morlok, MICRO-ID.

Подобные системы удобны в пользовании, они позволяют одновременно исследовать широкий спектр микробных признаков, всегда готовые к использованию в любых микробиологических лабораториях, они простые и надежные, требуют небольших объемов посевного материала, потому экономят лабораторную посуду, пипетки. Компьютерная обработка полученных результатов дает возможность быстро определить и оценить вид неизвестного возбудителя.

Изготовление питательных сред. В состав любых сред входят преимущественно натуральные животные или растительные продукты и компоненты – мясо, рыбная мука, яйца, молоко, кровь, дрожжевой экстракт, картофель и тому подобное. Из них готовят специальные полуфабрикаты в виде экстрактов, настоев, ферментативних и кислотных гидролизатів (мясная вода, дрожжевой экстракт, триптичнийгидролизатХоттингера, пептон и другие), которые являются основой для последующего конструирования питательных сред. Кроме этого, в питательные среды добавляют разные неорганические соли в зависимости от потребностей микробной клетки. Как правило, концентрация хлорида натрия составляет 5,0 г/л, KH2PO4 – 0,2-0,5 г/л, MgSO4·7H2O, другие соли добавляются из расчета 0,001 г/л. В необходимых случаях к составу вводят углеводы (сахара, многоатомные спирты), аминокислоты в концентрации 0,5-1,0 %, а также витамины (до 0,001 мг/мл).

Для обеспечения необходимой плотности среды используют агар-агар, который получают из морских водорослей. Он является удобным и необходимым компонентом сред, поскольку не потребляется бактериями как ростовой субстрат. Образовывая в воде гель, он плавится при температуре возле 100 °С, а густеет при 40 °С. Источником желатина являются богатые на коллаген субстраты. Среди них хрящи, сухожилия, кости и тому подобное. Гель, который получают в результате использования желатина, плавится при температуре возле 32-34 °С и застывает при 28 °С. Однако многочисленные микроорганизмы способны расщеплять желатин, потому использование последнего как наполнителя среды считается нецелесообразным. Чаще всего такие среды с желатином применяются для определения протеолитических свойств бактерий.

Изготовление питательных сред является сложным динамическим процессом, который нуждается во внимании бактериолога. Этот процесс состоит из нескольких основных этапов. Сначала к дистиллированной воде согласно с прописью добавляют необходимые сухие компоненты среды, тщательным образом перемешивают, растворяя при нагревании. Обязательно устанавливают рН среды, которую определяют или с помощью іонометра, или индикаторными бумажками. При этом следует обратить внимание, что после стерилизации реакция среды падает на 0,2. Среды, которые содержат агар, фильтруют через ватно-марлевый фильтр в горячем состоянии, жидкие среды – через бумажные фильтры. Если есть необходимость, их освітляють осаждением или с помощью белка куриного яйца или сыворотки. Среды разливают в специальные матрасы, колбы, флаконы и закрывают ватно-марлевыми пробками с бумажными колпачками. В зависимости от состава среды используют разные режимы стерилизации. Да, среды, которые содержат углеводы, желатин стерилизуют в автоклаве 15 мин при температуре 112 °С или текучей парой при температуре 100 °С дробно. Среды без углеводов можно стерилизовать в автоклаве при 115-120 °С в течение 20 мин. Если в состав сред входят неустойчивые к температуре компоненты, такие, как нативний белок, сыворотка, мочевина, то они стерилизуются или фильтрованием через бактериальные фильтры, или их добавляют готовым в стерильную среду. Контроль стерильности сред осуществляют путем витримування их в термостате в течение нескольких суток при температуре 37 °С.

Приводим примеры изготовления некоторых простых питательных сред, которые чаще всего используются в микробиологической практике и могут быть основой для изготовления более сложных.

Мясная вода. Для ее изготовления используют свежую говядину, которую предварительно очищают от жира, фасций, сухожилий и тому подобное, разрезают на мелкие куски и пропускают через мясорубку. Полученный фарш заливают водопроводной водой в соотношении 1:2, размешивают и на сутки оставляют в прохладном месте. Полученный настой кипятят в течение 30-60 мин, периодически снимая накипь, а затем отстаивают. Отделяют жидкость от фарша, фильтруют через фильтровальную бумагу или полотно и доливают водопроводной водой к первичному объему, потом разливают в флаконы и стерилизуют при 1 атмосфере (температура 120 °С) в течение 30 мин. Стерильная мясная вода прозрачна, имеет желтоватый цвет, а на стенках флакона и на дне образуется осадок из белков, которые свертывались. Потому при последующем использовании среды его опять фильтруют. Активная реакция среды – 6,2.

Мясо-пептонныйбульйон (МПБ). Чтобы изготовить МПБ, к мясной воде добавляют 1 % пептону и 0,5 % хлориду натрия, устанавливают необходимое рН с помощью 20 % раствору NAOH и кипятят 30-40 мин, постоянно перемешивая. Бульйон фильтруют через бумажный или полотняный фильтры, разливают в флаконы, пробирки, проверяют активную реакцию среды и стерилизуют при 120 °С в течение 20 мин.

М’ясо-пептоннийагар (МПА). К мясо-пептонного бульйону добавляют мелко нарезанный агар-агар (2-2,5 %). Полученную смесь кипятят к растворению агар-агара, фильтруют, устанавливают рН и разливают в флаконы. Стерилизацию проводят в течение 20 мин при температуре 120 °С.

Среды с кровью, сывороткой или асцитическойжидкостью. Поскольку эти среды не могут долго сохраняться, их готовят непосредственно перед применением. Для этого к растопленному и охлажденному до 45-50 °С МПА додают стерильно 5-10 % свежей или дефибринированной крови барана, кролика или другого животного. Флаконы с агаром тщательным образом перемешивают и разливают в чашки Петри, следя за отсутствия пены.

Идентично готовят сывороточный (5-10 % сыворотки крови) или асцитичныйагар (25 % асцитичной жидкости).

Триптичнийперевар за Хоттингером.Бульйон из него более экономический чем другие мясо-пептонные среды, поскольку позволяет из одной порции мяса получить в несколько раз больше бульйона. В этой среде содержится большое количество аминокислот, следовательно, повышается его буферність, и за счет этого стабильнее является значение активной реакции среды.

Для изготовления перевара берут один килограмм мяса без сухожилий и жира, порезанный на мелкие куски размером до 1-2 см, окунают в кастрюлю с двойным объемом воды, которая кипит, и кипятят 15-20 мин, пока мясо не станет серым, что свидетельствует о коагуляции белков. Его вынимают из жидкости и пропускают через мясорубку. В жидкости, которая осталась, устанавливают рН 8,0, опускают туда фарш и охлаждают до 40 °С. Потом добавляют 10 % (к объему жидкости) свежей поджелудочной железы, предварительно очищенной от соединительной ткани, жиру и дважды пропускают через мясорубку. Вместо железы используют сухой препарат панкреатина (0,5 %). Полученную смесь тщательным образом взбалтывают и доводят рН до 7,8-8,0. Через 30 мин проверяют рН. Если активная реакция среды не изменяется в кислую сторону, это свидетельствует о недоброкачественности фермента. Когда рН среды стабилизируется, смесь переливают в большие бутыли, заполняя их на 1/3. Добавляют до 3 % хлороформу, закрывают посуду резиновими пробками и интенсивно взбалтывают для перемешивания жидкостей. Избыток паров хлороформа выпускают. Через 1-2 год опять проверяют рН среды, устанавливая его на 7,4-7,6.

Добавить материал

Полученную смесь оставляют при комнатной температуре сроком до 16 дней. В течение первых 3-4 дней ежедневно проверяют и корректируют рН среды, а также взбалтывают флаконы не меньше, чем 3 разы в сутки. Позже эту процедуру можно не проводить и взбалтывать среду следует не так часто. За 1‑2 дня до окончания цикла переваривания взбалтывания среды прекращают.

О завершенном качественном переваривании свидетельствуют просветления жидкости, которая приобретает соломенно-желтый цвет, а также образование на дне пылевидного осадка. Жидкость легко фильтруется, ее проверяют на наличие триптофана с помощью пробы с бромной водой (до 3-4 мл фильтрата добавляют 3-4 капли бромной воды). При наличии триптофана (до 2,0-3,0 г/л) цвет среды изменяется на розово-фиолетовый. Определяют общий азот, который в норме достигает 11,0-12,0 г/л, и аминный азот (до 7,0-9,0 г/л).

Гидролизат фильтруют через бумажный или полотняный фильтр, разливают в бутыли и автоклавують при 120 °С в течение 30 мин. В таком виде он может сохраняться длительное время.

Его используют для получения бульйонаХоттингера. С этой целью до 100-200 мл гидролизат у добавляют 800-900 мл дистиллированной воды, 0,5 % хлориду натрия и 0,2 % однозамещенного фосфорнокислого натрия. Доводят рН до 7,4‑7,6, разливают в флаконы и стерилизуют 20 мин при 120 °С.

Мясо-пептоннийагар на основе гидролизат уХоттингера готовят за рецептурой обычного МПА.

Сегодня, как правило, бактериологи пытаются пользоваться стандартными сухими питательными средами, которые выпускает бактериологическая промышленность. Такие среды позволяют существенно улучшить результаты микробиологических исследований и стандартизировать их.

Для культивирования бактерий широко применяют безбелковые среды, в которых хорошо растут много органотрофних, в том числе патогенных видов бактерий. В эти среды входят много компонентов.

Культивирование в синтетических средах с использованием метода меченых атомов дает возможность детальнее дифференцировать бактерии за характером их биосинтеза.

Для дифференциации прототрофних и ауксотрофних бактерий широко используют селективные среды.

Прототрофы растут на минимальной среде, которая содержит только соли и углеводы, поскольку они сами могут синтезировать нужные им для развития метаболиты, тогда как ауксотрофы нуждаются в среде, которая содержит определенные аминокислоты, витамины и другие вещества.

На густых питательных средах бактерии образуют разные по форме и величине колонии— видимые скопления микроорганизмов одного вида, которые формируются в результате размножения из одной или нескольких клеток. Колонии бывают плоскими, выпуклыми, куполообразными, вдавленными, их поверхность — гладкой (S-фор-ми), шершавой (R-формы), исчерченной, бугорчатой, края — ровными, зазубренными, волокнистыми, бахромчатыми. Форма колоний также разнообразна: круглая, розеткообразная, звездчатая, деревовидная. По величине (диаметру) колонии разделяются на большие (4— 5 мм, средние (2—4 мм), мелкие (1—2 мм) и карликовые (меньше 1 мм).

Источник

• Популярная книга Круть доступна для чтения прямо сейчас на нашем сайте boochi.ru. Скачать книгу в формате FB2, TXT, PDF, EPUB бесплатно без регистрации. →