Для чего нужен пцр
Принцип ПЦР исследования
Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)? Практически каждый человек в жизни сталкивается с этим методом, даже если не знает об этом. ПЦР исследует генетический материал – ДНК или РНК. Благодаря открытию ПЦР медицина и наука вышли на новый уровень и стала возможной точная диагностика различных инфекций, наследственных и онкологических заболеваний, установление отцовства и даже клонирование генов. ПЦР широко используется в криминалистике, раскопках и других областях, поскольку источником ДНК может быть капля крови, оставленная на месте преступления или человеческий волос, и даже останки мумии или мамонта, пролежавших тысячи, миллионы лет…
Но сегодня нас будет волновать ПЦР как точный метод диагностики инфекционных заболеваний, где он заслуженно удостоен звания «золотой стандарт». В основе метода – поиск ДНК микроорганизмов, то есть точное установление «личности» микроба, ставшего причиной заболевания.
Как работает ПЦР?
Всем известно из курса биологии, что генетический материал всего живого на Земле представлен двухцепочечной молекулой ДНК (кроме некоторых вирусов, содержащих РНК). Каждая цепочка ДНК состоит из комбинации четырех нуклеотидов. Да-да, нуклеотидов всего 4, но из них составлен генетический материал всех живых существ. Разница лишь в определенной последовательности нуклеотидов в цепочках ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов в участке ДНК искомого микроорганизма, возможно его выявить в любом биологическом материале.
Принцип ПЦР заключается в многократном удвоении (амплификации) участка ДНК при помощи специальных ферментов.
Почему реакция называется полимеразная цепная?
В чём преимущества ПЦР?
Для грамотного применения метода следут запомнить следующие моменты:
ПЦР выявляет ДНК возбудителя независимо от того, живой он или мёртвый, поэтому:
Для выявления ДНК внутриклеточных инфекционных агентов ( например, вирусов) нужны клетки, поэтому:
Слизь, кровь и гной могут заблоктровать реакцию ПЦР, поэтому:
Проведение ПЦР требует строго соблюдения условий технологии, поэтому в лаборатории KDL:
Будьте здоровы и обследуйтесь в лаборатории, которой доверяете!
ПЦР-диагностика
Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).
Принцип ПЦР- исследования
Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?
Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.
Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.
В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.
Как это все происходит в лаборатории
Выделение ДНК
Элонгация
Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.
Детекция
Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:
Преимущества методики ПЦР
Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).
Области применения в медицине
В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.
Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:
Роспотребнадзор (стенд)
Роспотребнадзор (стенд)
ПЦР – диагностика. Просто о сложном
ПЦР – диагностика. Просто о сложном
С чего она начиналась. Конечно, с предшествующих открытий ДНК, принципа комплементарности, составляющих её аминокослот и использования фермента полимеразы для увеличения количества фрагментов лизированной ДНК.
Что такое – ПЦР – диагностика? ПЦР – это полимеразная цепная реакция. Из названия становится ясно, что основной компонент реакции – фермент полимераза, причем необходима термоустойчивая разновидность. Цепная реакция – это потому, что протекает она по типу ядерной реакции. В короткое время обеспечивается увеличение количества определяемой нуклеиновой кислоты в 2-4-8-16 и т. д. раз в геометрической прогрессии…
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR)изобрёл в 1983 году американский учёный Кэри Мюллис, работавший в области молекулярной биологии над созданием прибора под названием амплификатор.
Интересны обстоятельства, при которых у него появилась эта идея. Вот как это было… Открытию предшествовали размышления исследователя о проблеме разрушения обычной полимеразы в процессе воздействия высоких температур (до 95 град. С). В тёплую лунную майскую ночь биолог возвращался со своей дамой с дружеской вечеринки, девушка спала на заднем сидении кабриолета… Кэрри Мюллис вёл машину по пустынной дороге, освещенной лунным светом. И вот при таких романтических обстоятельствах у него появилась идея использовать полимеразу термоустойчивых бактерий, обитающих в термальных источниках!
В 1993 г. за воплощение в лабораторную практику молекулярной биологии этого изобретения он получил Нобелевскую премию.
В настоящее время ПЦР-диагностика является одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний, наследственных патологий, определения генетически модифицированных продуктов, идентичности биологического материала, в том числе в судебной практике.
ПЦР – диагностика стала необходимым элементом при постановке диагноза вирусных гепатитов В и С, назначении лечения интерферонами и его корректировке по дозам и срокам специфического лечения.
Различают методы ПЦР: с учётом по конечной точке методом электрофореза, флюоресцентной детекции на приборах «АЛА 1\4» (Латвия), «Джин» ( Россия), полуколичественный метод, и самый современный метод – в режиме реального времени с использованием надёжного специального оборудования.
Эпидемии гриппа А Н1N1 (Калифорния 09) 2009 г. и прошедшего эпидсезона 2015-2016 годов показали, что Роспотребнадзор по Республике Дагестан успешно справился с задачей диагностики гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций у больных с тяжёлыми формами респираторной патологии.
ПЦР – диагностика с помощью мультиплексных тест-систем (на несколько инфекций) с успехом используется не только в диагностике ОРВИ, пневмоний, менингитов, а также для расшифровки вспышек пищевых токсикоинфекций, как на бактерии, так и на вирусы.
ПЦР-тест
Методика, преимущества и недостатки анализа
Полимеразная цепная реакция – что это такое, какие заболевания выявляет, в чем преимущества и недостатки анализа и что значат его результаты – в материале РИА Новости.
Анализ ПЦР
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий обнаружить в организме человека различные инфекционные заболевания. В его основе лежит многократное увеличение малых концентраций фрагментов РНК и ДНК. Полимеразная цепная реакция была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом. Он хотел добиться того, чтобы можно было создать множество копий ДНК за счет фермента ДНК-полимеразы, который участвует в ее репликации. За это Муллис получил Нобелевскую премию по химии. Известно, что еще в начале 1970-х годов похожий метод был представлен другим ученым, однако задумку так и не смогли реализовать. Позже анализ был значительно усовершенствован и широко используется в биологической, биохимической и медицинской практике.
Как работает ПЦР
Для проведения анализа необходимо сложное, современное оборудование.
«Применяется специальный прибор, он называется амплификатор, в который помещается частица вируса или еще что-нибудь, содержащее РНК или ДНК, – рассказал РИА Новости кандидат медицинских наук, клинический фармаколог Андрей Кондрахин. – Дело в том, что РНК и ДНК достаточно маленькие, чтобы их определить, и понять есть ли в теле человека вредоносные микроорганизмы, поэтому делают ПЦР-тест. В большую машину кладут частичку вируса, но она его не распознает, затем добавляются специальные компоненты, праймеры, которые позволяют сделать большое количество этих цепочек РНК. Их становится так много, что машина начинает их «видеть». Даже если есть хоть самая маленькая РНК вируса, например, коронавируса, это позволяет создать множество копий инфекции, что помогает определить, присутствует она в организме или нет. Метод дает результат практически стопроцентной точности. Для определения COVID-19 есть отдельный праймер. Там находится большое число нуклеотидов, из которых строится будущая РНК. Она сначала разрушается, а потом заново выстраивается. Реакция называется цепной, потому что очень быстро это происходит. Как только копий становится много, сразу начинается считывание».
Применение ПЦР
ПЦР-тест обнаруживает наличие возбудителей вирусных заболеваний, когда другими методами этого сделать нельзя. Например, иммунологическими, бактериологическими и микроскопическими исследованиями. Также значительную роль играет фактор времени, потому что анализ делается довольно быстро по сравнению с другими.
«Метод применяется не только для вирусов, но и частичек ДНК, а также бактерий, – пояснил специалист. – Например, мы можем определить, к какому виду бактерия относится, например, к грамотрицательным или грамположительным».
Полимеразную цепную реакцию применяют в криминалистике, когда нужно сделать анализ ДНК с места преступления, его потом сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Также используется для установления отцовства или материнства, нахождения в организме человека вирусов и бактерий, выявления аллергии на некоторые лекарства или их токсичности.
Проведение ПЦР
Для анализа требуется ДНК- или РНК-матрицы, участки которых нужно скопировать, два праймера с необходимыми ферментами, термостабильная ДНК-полимераза, а также некоторые другие компоненты. Метод ПЦР выявляет любую ДНК или РНК живого или мертвого возбудителя. Для их определения используют особые праймеры, в которых содержатся вырожденные позиции РНК или ДНК.
Подготовка материала
Этот этап чрезвычайно важен для проведения анализа ПЦР, потому что большинство ошибок, до 70% случаев, совершается именно во время пробоподготовки, что влияет на конечный результат анализа. Чтобы этого избежать, нужно правильно забрать материал для тестирования и подготовить его. Поэтому во многих лабораториях при заборе крови используются вакуумные системы, которые меньше травмируют человека и не допускают того, чтобы материал для анализа контактировал с окружающей средой или персоналом.
Какие биологические материалы исследуются
В исследовании обычно используются различные биоматериалы:
– Моча. Такой анализ позволяет выявить инфекции мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин.
– Мокрота. Применяется для обнаружения туберкулеза и некоторых других заболеваний легких.
– Биологические жидкости – околоплодная, спинномозговая, суставная и т.д.
– Соскобы со слизистых оболочек, например, носа или ротоглотки. В основном применяется для обнаружения заболеваний, которые передаются половым путем, а также коронавируса.
– Кровь, сыворотка, плазма. Используются для определения вирусов ЦМВ (цитомегаловируса), ВИЧ, гепатитов B, C, D, G, герпеса, а также исследований человеческих генов.
– Биоптаты. Их забирают методом биопсии.
Преимущества и недостатки метода
ПЦР отличается от других исследований тем, что может обнаружить несколько разных возбудителей одновременно. Для него нужно сдать только один анализ, никаких дополнительных тестов не требуется.
«Преимуществом метода является то, что можно определить возбудителя в малом количестве, просто в мизерном, – объяснил клинический фармаколог. – Благодаря этому можно быстрее поставить диагноз, потому что мы знаем, какой именно микроорганизм начинает развиваться. В тесте пишется концентрация выявленных у ДНК и РНК микроорганизмов, если берется мазок из носа или ротовой полости, а также к какому классу они принадлежат. То есть присутствует четкое понимание, к какому типу относится возбудитель и каково его количество. Мало, много, либо его вообще нет в организме».
По словам Андрея Кондрахина, к одному из минусов теста относятся сложности при заборе материала:
«Самый первый недостаток метода – необходима абсолютная чистота в помещении, ближе к стерильности, потому что попадание даже мельчайших инородных объектов может дать неправильный результат из-за того, что чувствительность аппарата очень высокая. Сразу начнется увеличение концентрации этих частиц, которое машина может прочитать. Второе – чтобы пошла реакция, нужны специальные материалы, праймеры. Для каждой реакции есть свои праймеры – кусочки, из которых будут создаваться новые РНК. Тест небыстрый – по времени может занимать около суток. Кроме этого, нужен обученный, высокопрофессиональный персонал. Сами аппараты довольно громоздкие, хотя сейчас уже есть и установки меньшего размера. Но чем больше машина, тем больше она может прочитать. Это система не для мобильного использования».
Загрязнение материала для теста может произойти также, если при его транспортировке были допущены ошибки, из-за непригодности реагентов, попадании в них крови, клеток эпителия, большого количества слизи.
Разновидности ПЦР
ПЦР-тест бывает нескольких видов:
– ПЦР с обратной транскрипцией. Его применяют для амплификации РНК.
– Инвертированная ПЦР используется, если для анализа есть маленький участок последовательности ДНК или РНК.
– Вложенная ПЦР нужна для уменьшения побочных реакций, для этого в амплификатор помещают два праймера.
– Количественная ПЦР применяется для наблюдения за изменением цепной реакции.
– Ступенчатая ПЦР позволяет снизить связывание праймеров.
Кроме этого, есть асимметричная ПЦР и групп-специфическая ПЦР.
«Существует методика проведения ПЦР в реальном времени, – рассказал Андрей Кондрахин. – Это самый быстрый анализ, как говорится, здесь и сейчас. Его делают при помощи прибора, в котором есть картридж, определяющий только одну инфекцию, например, коронавирус. Кроме него аппарат ничего не видит, как и при обычном ПЦР, однако в таком случае результат можно получить намного быстрее».
Какие инфекции позволяет выявить
Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить у человека инфекционные заболевания, например:
– уреаплазмоз половых органов;
– наличие раковых клеток;
Также тестирование помогает выявить наследственную предрасположенность человека к некоторым заболеваниям и оценить гормональный фон.
ПЦР-тест на COVID-19
Для ПЦР-теста на коронавирус у человека берется мазок из носа и ротоглотки. Во время пандемии его рекомендуют сдать всем, кто болеет ОРВИ, гриппом, пневмонией и т.д. Берут материал для анализа амбулаторно, также специалист может выехать на дом. Согласно требованиям, пациента выписывают после двух отрицательных тестов на наличие инфекции. ПЦР-тесты могут давать ложноположительный или ложноотрицательный результат, в таком случае необходимо повторное исследование.
Как подготовиться к сдаче анализа
«Специальной подготовки вообще не требуется, разве что не принимать пищу за три часа (минимум) перед забором материала, если будут брать мазок из ротовой полости. Частички еды могут извратить результат. Достаточно прополоскать рот с водой и идти на анализ», – пояснил специалист.
Перед мазком также не рекомендуется пить кофе, чай, иные напитки, чистить зубы, полоскать рот освежающими смесями, жевать жевательную резинку, курить. Нос нельзя промывать, закапывать туда капли или мазать лекарствами. Если берут кровь, то ее необходимо сдавать натощак, чтобы результат был максимально точным. Мочу следует собирать в утреннее время суток натощак или через 2-3 часа после приема пищи. Желательно сделать это сразу после сна.
Расшифровка анализа ПЦР
После проведения теста результаты оцениваются и аппаратурой, и специалистами-медиками.
«В конце теста машина сообщает, что она нашла в мазке, а врач-лаборант описывает результат, – объяснил эксперт. – Если в программу машины заложена информация о том, при каких количествах считается тест положительным, значит, это будет делать автомат. В анализе будет либо да, либо нет. Самому человеку ничего расшифровывать не нужно, единственное, что специалист может посмотреть за машиной – это количество кусочков РНК, потому что бывают ложноположительные или ложноотрицательные результаты, если в аппарате произошел сбой. Все равно контроль со стороны врача присутствует».
Насколько точна ПЦР-диагностика инфекций
«ПЦР абсолютно точна, практически 99,9%, потому что аппарат построит абсолютно такую же РНК, как слепок с ключа, один в один. Там ничего нового сделать нельзя. Набор частичек увеличивается до того количества, которое может распознать машина. Сделать это можно, даже если частиц очень мало», – отметил Андрей Кондрахин.
При этом из-за того, что зачастую встречаются ошибки при взятии биологического материала и существует вероятность попадания инородных частичек, могут возникать ложноположительные или ложноотрицательные результаты тестирования на коронавирус.
Интересно и полезно
Полезная информация для каждого
Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 году Кэри Маллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию.
Полимеразную цепную реакцию используют для анализа индивидуальных вариаций последовательности нуклеотидов определенных локусов, для повышения эффективности клонирования целевых последовательностей изучаемых геномов и их прямого секвенирования, для детекции в организме патогенных микроорганизмов и т. п.
Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований.
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
Праймеры- короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 18—30 оснований комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
Реакция проводится в 30-50 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий
Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.
Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии— 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).
Элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки.Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 мин.
Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) растет экспоненциально, а количество «длинных» копий ДНК линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент ДНК. Через некоторое количество циклов рост количества продуктов замедляется за счет ограничения количества реагентов, наличия ингибиторов, появления побочных продуктов реакции.
ПЦР реального времени (real-time PCR)
Real-time PCR это группа методик, дающие возможность качественного анализа продуктов ПЦР в режиме реального времени по ходу проведения реакции. Основными этапами данного метода являются:
Кинетическая кривая PCR в координатах «Уровень репортерной флуоресценции — цикл амплификации» имеет S-образную форму. В ней можно выделить три стадии:
Полимеразная цепная реакция, известная более как «ПЦР» не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он и был удостоен Нобелевской премии. Часто её описывают как метод, с помощью которого ученые могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл.«Иглой» является крошечный фрагмент генетического материала, а ПЦР не только точно обнаруживает этот фрагмент, но и затем, используя естественное свойство ДНК- репликацию (размножение), делает его копии.
В течение нескольких часов с помощью ПЦР из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить более 100 млрд. идентичных молекул.Таким образом, можно изучить генетический материал, присутствующий в крошечных количествах. Принцип этой реакции достаточно прост и теоретически для её исполнения нужны лишь пробирка, несколько реагентов и источник тепла. Препарат ДНК, который необходимо копировать, может быть чистым, а может представлять собой очень сложную смесь биологических веществ. В качестве источника ДНК подходит и биоптат ткани пациента, и одиночный человеческий волос, и капля засохшей крови, обнаруженная на месте преступления, и мозг мумии и даже тело мамонта, пролежавшего 40 000 лет в вечной мерзлоте.
Анализ генетического материала особенно актуален для медицинской диагностики и ПЦР открывает для этого новые перспективы. ПЦР — метод молекулярной диагностики, ставший для ряда заболеваний «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически.
Что же может ПЦР? Основные медицинские области применения этого метода – диагностика инфекций и наследственных заболеваний.ПЦР открывает поистине фантастические возможности анализа генома человека – выявления дефектных генов, определяющих наследственную предрасположенность к заболеваниям.Вместе с тем, интересно и обнаружение генов, несущих информацию о полезных признаках.Например, генов снижающих риск опухолевого перерождения тканей или генов, значительно уменьшающих вероятность заражение ВИЧ-инфекцией.ПЦР используется также при генетической идентификации личности, определении степени родства.Только результат анализа ДНК позволяет окончательно дать заключение о достоверности отцовства.
Но, пожалуй, самое широкое распространение метод ПЦР в настоящее время получил как метод диагностики различных инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет выявлять этиологию инфекции даже если в пробе, взятой на анализ содержится всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР широко используется в для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов, клещевого энцефалита, туберкулеза, заболеваний, передающихся половым путем и т.д. На сегодняшний день практически нет инфекционного агента, которого нельзя было бы выявить с помощью ПЦР.
Всем известна длительность процедуры классических методов бактериологического выделения возбудителя туберкулеза: иногда подтверждение диагноза может занимать 5 –6 месяцев.Если использовать метод ПЦР, этот срок можно сократить до нескольких часов.Высокочувствительный анализ проведенный сразу после укуса клеща позволит ответить на вопрос произошло ли заражение вирусом клещевого энцефалита или боррелиозом – методы профилактики и лечения этих клещевых инфекций совершенно различны. Это лишь самые яркие примеры преимуществ данного анализа.
Важное значение метод имеет для мониторинга и оценки эффективности терапии, особенно при вирусных заболеваниях.Определение “вирусной нагрузки”, т.е. количества вирусных частиц в крови позволяет осуществить индивидуальный подбор дозы противовирусных препаратов. При помощи ПЦР удается выявить отдельные субтипы и штаммы вирусов и бактерий, обладающих повышенной устойчивостью к тем или иным лекарственным препаратам.
Говоря о несомненном прогрессивном значении метода ПЦР, его неоспоримых преимуществах, вместе с тем, следует знать и об определенных проблемах его проведения. Чрезвычайная чувствительность метода требует строго соблюдения специального технологического режима, тщательного выполнения всех этапов анализа в отдельных изолированных зонах лаборатории. Недостаточная внимательность к процедурным тонкостям влечет неизбежную контаминацию проб и появление ложноположительных результатов.
Широкое использование недостаточно отработанных тестов при диагностики урогенитальных заболеваний, к сожалению, часто приводит к неверному результату и необоснованному назначению дорогостоящей терапии, иногда оставляющей массу побочных эффектов. Таким образом, недобросовестное проведение анализа ведет к незаслуженной дискредитации метода.
Для правильной интерпретации результатов необходимо также знать, что выявление ДНК возбудителя не всегда говорит о состоянии его жизнеспособности, а также о непосредственной связи выявленного инфекционного агента с конкретным патологическим процессом.Результат ПЦР значительно увеличивает свою информативность при комплексном обследовании пациентов с дополнительным использованием других лабораторных (иммуноферментных, биохимических и др.) и клинических исследований.
Результаты научных исследований указывают на необходимость определения чувствительности перед назначением антимикробной терапии. Знание бактериальной резистентности к антибиотикам имеет важное значение для успешной борьбы с болезнью.
Назначение несвоевременной и неадекватной терапии внутрибольничных и тяжелых инфекций увеличивает вероятность летального исхода. Поэтому очень важно на ранних стадиях заражения выявить тип антибиотикорезистентности, чтобы подобрать адекватную схему лечения и использовать наиболее эффективные антибактериальные препараты. В случае тяжелых инфекций это нужно сделать в кратчайшие сроки.
В отличие от традиционных микробиологических методов, метод ПЦР позволяет проводить идентификацию генетических детерминант резистентности микроорганизмов, в том числе сложно культивируемых бактерий, в течение 4 часов. Он отличается высокой точностью и меньшими требованиями к забору материала, не требует наличия питательных сред, дисков с антибиотиками и дополнительных реактивов. Определение антибиотикорезитентности с помощью ПЦР позволяет спрогнозировать появление устойчивости к различным группам антимикробных препаратов, а также оценить распространение резистентных штаммов на локальном и региональном уровнях. Поэтому обнаружение антибиотикорезистентности методом ПЦР является отличным дополнением к традиционному микробиологическому тестированию.
В современной клинической практике можно выделить несколько вариантов антибактериальной резистентности, приводящих к крайне серьезным социально-экономическим последствиям. К таким вариантам относятся:
Большинство из перечисленных вариантов обусловлено приобретением бактериями данной группы той или иной генетической детерминанты устойчивости (таблица 1), обнаружение которой возможно с помощью ПЦР.
В ООО НПФ «Литех» разработана серия ПЦР-наборов для обнаружения генетически обусловленной устойчивости микроорганизмов к антибиотикам.
Грамотрицательные бактерии, в том числе возбудители нозокомиальных инфекций, как правило, реализуют устойчивость к b-лактамным антибиотикам за счет продукции многочисленных β-лактамаз, при этом один штамм может продуцировать несколько различных ферментов. Продуцируемые бактериями ферменты различны по своей субстратной специфичности, среди них выделяют следующие типы:
Генотипирование на основе ПЦР остается золотым стандартом детекции и идентификации β-лактамаз, в том числе металло-β-лактамаз.
Необходимость обнаружения генов blaSHV, blaTEM, ответственных за продукцию пенициллаз, или b-лактамаз узкого спектра действия (NSBL)
Штаммы, продуцирующие β-лактамазы узкого спектра действия (NSBL), обычно вырабатывают TEM-1 и/или SHV-1 ферменты, которые разрушают пенициллины и ранние цефалоспорины, но чувствительны к другим классам β-лактамных антибиотиков. Мутации в промоторном участке гена TEM-1 могут привести к гиперпродукции этих ферментов. Подобная гиперпродукция может обернуться устойчивостью к другим b-лактамным антибиотикам, помимо пенициллина. Точечные мутации в этих ферментах могут привести к возникновению устойчивости к ингибиторам β-лактамаз, например, сульбактаму и клавулановой кислоте. Устойчивые штаммы особенно опасны при лечении инфекций у детей, когда препаратами выбора являются пенициллины и ранние цефалоспорины. При неадекватной терапии существует риск перехода заболевания в хроническую форму.
Для обнаружения генов устойчивости к пенициллинам и ранним цефалоспоринам разработаны следующие наборы:
• Резистентность к пенициллинам – 1
Резистентность Enterobacteriaceae и Pseudomonas к пенициллинам и ранним цефалоспоринам. (Гены TEM)
Резистентность Enterobacteriaceae к пенициллинам и ранним цефалоспоринам. (Ген SHV-не ESBL)
Для обнаружения устойчивости энтеробактерий к цефалоспоринам разработан набор:
Резистентность Enterobacteriaceae к цефалоспоринам. (Гены CTX-M)
Необходимость обнаружения генов, ответственных за продукцию металло-бета-лактамаз, или карбапенемаз
Карбапенемы, главным образом имипенем и меропенем, являются основными агентами в борьбе с грамотрицательными палочками, обладающими множественной лекарственной устойчивостью. В этой связи распространение грамотрицательных бактерий, продуцирующих карбапенемазы, представляет серьезную проблему в сфере здравоохранения. С 2009 года Национальная референсная лаборатория Германии отслеживает молекулярную эпидемиологию карбапенемаз грамотрицательных нозокомиальных патогенов. В 2011 среди 1454 бактериальных изолятов устойчивость к карбапенемам была обнаружена у 34,4% штаммов Enterobacteriaceae, 19,9% штаммов Pseudomonas aeruginosa и в 96,3% изолятов Acinetobacter baumannii.
Распространение NDM-1 гена, кодирующего Нью-Дели металло-b-лактамазу (NDM-1) в Enterobacteriaceae, является одной из основных проблем глобального здравоохранения. Продукт гена NDM-1 способен гидролизовать практически все b-лактамные антибиотики и в сочетании с другими механизмами резистентности делает бактерию устойчивой почти ко всем антибиотикам. Первоначально плазмиды, кодирующие blaNDM-1, были обнаружены у Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli. Посредством конъюгации плазмиды могут передаваться и другим видам. Недавно blaNDM-1 были обнаружены в Acinetobacter baumannii и Vibrio cholerae.
NDM ферменты, такие как NDM-4, сейчас эволюционируют в более каталитически активные варианты.
Инфекции крови, вызванные OXA-48-продуцирующими Enterobacteriacea, имеют плохой прогноз, поскольку часто происходит задержка между постановкой диагноза и началом адекватной терапии.
Обнаружение способности продуцировать металло-β-лактамазы различными представителями грамотрицательных бактерий, оценка масштабов встречаемости кодируемых их генов в клинических образцах важны для предотвращения распространения инфекции и проведения адекватной этиологической терапии пациентов.
Задачу обнаружения генов, кодирующих карбапенемазы, решают следующие наборы:
Резистентность Enterobacteriaceae и Pseudomonas к карбапенемам. (Гены VIM)
Резистентность Enterobacteriaceae к карбапенемам. (Гены NDM)
Резистентность Enterobacteriaceae к карбапенемам. (Гены OXA-48)
Грамположительные бактерии, как правило, реализуют устойчивость к b-лактамным антибиотикам за счет модификации пенициллин-связывающих белков (ПСБ), являющихся их мишенями действия. В частности, стафилококки способны синтезировать ПСБ2а, обладающий сниженной аффинностью к пенициллинам (метициллину и оксациллину) и цефалоспоринам. Способность к продукции такого белка кодируется геном MecA, передающимся в популяции в составе мобильной хромосомной кассеты.
• Резистентность к цефалоспоринам- 2
Резистентность S. aureus к b-лактамным антибиотикам. (Ген MecA)
Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium являются причиной 85-90% энтерококковых и третьей по частоте причиной внутрибольничных инфекций, особенно бактериемии, сепсиса у детей, эндокардита, инфекций мочевыводящих путей. Большинство больничных изолятов энтерококков устойчивы к обычным антибиотикам, устойчивость к ванкомицину достигает 40% популяции. Два гена резистентности (VanА и VanB) являются наиболее распространенными, особенно среди E. faecium. Штаммы с VanА геном устойчивы к ванкомицину и тейкопланину, штаммы с VanB устойчивы к ванкомицину, но сохраняют чувствительность к тейкопланину.
Ванкомицин-устойчивые энтерококки (VRE) являются важными этиологическими агентами внутрибольничных инфекций. Частота обнаружения VRE особенно высока в отделениях интенсивной терапии новорожденных в связи с иммунной недостаточностью у новорожденных, частым использованием антибиотиков и длительного срока госпитализации.
По данным последних публикаций метод ПЦР является наиболее быстрым и чувствительным методом для одновременного обнаружения энтерококков и определения их резистентности к ванкомицину. Среднее время проведения ПЦР и стандартного микробиологического исследования занимает 10 часов и 5 дней, соответственно.
Для выявления устойчивости энтерококков к гликопептидным антибиотикам разработан набор:
• Резистентность к гликопептидам
Резистентность E. faecalis и E. faecium к ванкоминицу и тейкопланину. (Фенотипы VanA и VanB).