Для чего нужна электронная микроскопия

Электронная микроскопия

Электронная микроскопия – один из методов исследования микроструктуры твердых тел, их электрических и магнитных полей, локального состава с применением совокупности электронно-зондовых методов. Данная технология была запатентована в 1931 году Р. Руденбергом, который создал первый в мире электронный микроскоп. Сегодня – это один из наиболее эффективных и передовых методов исследования, который широко используется на предприятиях, в научных, учебных лабораториях.

Метод электронной микроскопии

Данная технология стала основой в создании электронных микроскопов – приборов, в которых для построения изображения используется не световой луч, а поток электронов в вакуумной среде. Роль оптических линз, которые используются в обычных микроскопах, здесь отведена электронному полю. Именно оно и фокусирует электроны. Электромагнитное поле формируется электромагнитными катушками.

Изображение передается на флюоресцирующий экран, где его можно сфотографировать и рассмотреть детально. К изучаемым объектам предъявляется ряд требований:

Разрешающая способность у электронных микроскопов значительно выше, чем у оптических. Величина 0,15 нм (15 А) позволяет получать увеличение в миллионы раз, что идеально подходит для изучения микроскопических объектов.

Основные особенности

Суть метода электронной микроскопии в том, что через исследуемый образец подается электронный пучок разной энергии. Под воздействием электромагнитного поля он фокусируется на поверхности в виде пятна, в диаметре не превышающего 5 нм. Это пятно и выполняет «изучение» объекта. Соприкасаясь с поверхностью, электронный пучок частично проникает в нее, вытесняя не только электроны, но и фотоны. Они попадают на лучевую трубку, где и из них и формируется изображение.

В сравнении со световыми (оптическими) микроскопами, электронные обладают преимуществами:

Виды электронной микроскопии

Выделяют 2 основных вида электронной микроскопии:

Просвечивающая электронная микроскопия

В микроскопах, работающих по этой технологии на объект, воздействует пучок ускоренных электронов, обладающих энергией от 50 до 200 кэВ. Те электроны, которые образец не пропустит, будут отклоняться на небольшой угол. И они, и те, которые пройдут через исследуемый объект с незначительными энергетическими потерями, попадают на магнитные линзы. В результате на фотопленке или люминесцентном экране формируется изображение внутренней структуры. Хорошие результаты дает при исследовании ультратонких образцов – менее 0,1 мкм в толщину.

При работе с ПЭМ одна из наиболее важных задач – различать природу контрастов:

Одна из разновидностей ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения (ВРЭМ). Формируется в случае, когда пучок электронов падает параллельно оси кристаллов в условиях фазового контраста. Позволяет диагностировать даже мельчайшие неоднородности кристаллической решетки.

Сканирующая электронная микроскопия

Сканирующей электронной микроскопией (СЭМ) получают изображения поверхности исследуемого образца с высокой разрешающей способностью. Получают трехмерные картинки, которые будут удобными в процессе изучения структуры. Дополнительно можно использовать методики EDX, WDX, чтобы получить информацию о химическом составе околоповерхностных слоев.

В оборудовании сфокусированный электронный пучок средней энергии сканирует образец. Предусмотрено несколько режимов работы:

Эти методики позволяют не только изучать свойства поверхности, но и получать наглядную информацию о структурах, расположенных на несколько микрон ниже верхнего слоя.

СЭМ может работать только с образами, которые можно погружать в вакуум – твердыми. Жидкие среды предварительно подвергают криозаморозке. Форма и размеры образца ограничиваются только размерами рабочей камеры микроскопа. Эффективность исследования можно повысить путем напыления слоя токопроводящего материала.

Возможности

Технология электронной микроскопии постоянно развивается:

Благодаря последним наработкам метод электронной микроскопии используют уже и при работах с влажными образцами, исключая нарушение их структуры и локального состава. Для этого применяется низкотемпературное замещение воды, сверхбыстрое замораживание в среде хладагента, прижим к металлу, который охлаждается жидким азотом и пр. Существенно возможности метода расширило использование компьютерной техники, в частности математическая обработка электронных изображений. Теперь изображения можно запоминать, корректировать контрастность, добавлять оттенки цветов, выделять микроструктуры, убирать шумы, выделять границы исследуемых участков и пр.

Области применения

Метод электронной микроскопии используют для изучения поверхности объектов, ультратонких срезов тканей, микробов. С его помощью определяют строение жгутиков, вирусов и пр. Оборудование, основанное на этой технологии, широко используется в различных научных и производственных отраслях:

Главная задача – подобрать микроскоп, работающий электронным методом под особенности предстоящих работ. В каталоге компании «Sernia Инжиниринг» можно подобрать подходящее оборудование для любой научно-исследовательской и производственной задачи. Приборы поставляются по Москве, Санкт-Петербургу и в другие регионы РФ. Все они имеют сертификаты соответствия, на них действуют гарантии. Узнать актуальные цены, условия сотрудничества, получить консультации и помощь в выборе можно у менеджеров компании. Свяжитесь с ними по телефону или через онлайн-форму.

А.С.Илюшин, А.П.Орешко. Введение в дифракционный структурный анализ. М.: физический факультет МГУ, 2008

Источник

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

Электронная микроскопия — метод морфологического исследования объектов с помощью потока электронов, позволяющий изучать структуру этих объектов на макромолекулярном и субклеточном уровнях.

После выпуска первой промышленной модели просвечивающего (трансмиссионного) электронного микроскопа (см.) электронная микроскопия прошла большой путь развития и позволила перейти на качественно новый уровень изучения материи. Электронная микроскопия нашла широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, биохимии, онкологии, медицинской генетике, иммунологии. Благодаря электронной микроскопии раскрыта субмикроскопическая структура клеток, открыт ряд неизвестных ранее клеточных органелл, таких как лизосомы (см.), рибосомы (см.), эндоплазматический ретикулум, микротрубочки, цитоскелет, структуры, специфичные для отдельных видов клеток (см. Клетка). Электронная микроскопия позволила понять многие тонкие механизмы развития болезней, в том числе на ранних этапах их возникновения, еще до появления четкой клинической симптоматики.

Электронная микроскопия все шире применяется для ранней диагностики заболеваний, а также для выявления этиологии инфекционных процессов. Ее используют в онкологии для определения гистогенеза опухолей (см.), что имеет важное значение в лечении и прогнозе онкологического заболевания. В нефрологии исследование с помощью электронной микроскопии материала, полученного при пункционной биоп сии, позволяет выявить ранние морфологические изменения структур почек, диагностировать форму гломерулонефрита (см.) и т. п. При электронной микроскопии пунктатов печени удается провести дифференциальную диагностику гематитов (см. Гепатит), гепатозов (см.) и других заболеваний печени, определить активность процесса и нередко его этиологию.

Исследования строения материи на субклеточном и макромолекулярном уровнях сдерживаются возможностями разрешающей способности электронных микроскопов (см. Электронный микроскоп). Использование электронной микроскопии в сочетании с другими методами, например с авторадиографией, гистохимическими, иммунологическими методами, обусловило появление электронной авторадиографии, (см.), электронной гистохимии (см.), иммунной электронной микроскопии (электронной иммуноморфологии) и др. Это позволило значительно расширить информацию, получаемую с помощью электронной микроскопии, наблюдать структурное выражение течения биохимических процессов в клетке, что, в свою очередь, подтвердило один из основных методологических принципов современной биологии — диалектическое единство структуры и функции.

Электронная микроскопия требует специальной подготовки объектов изучения, от которой в значительной мере зависят возможности метода. В соответствии с целями исследования методика такой подготовки может быть различной. Однако непременным условием при любых электронно-микроскопических исследованиях является фиксация тканей или микробов с максимальным сохранением их прижизненного строения. Существует два принципиально различных способа фиксации — химический и физический; каждый из них имеет различные варианты.

В электронной микроскопии, как правило, используют химическую фиксацию с помощью фиксаторов, обладающих стабилизирующими свойствами. Универсального для любых тканей фиксатора не существует, поэтому в зависимости от задач конкретного исследования применяют соответствующие фиксаторы. При выборе хим. фиксаторов исходят из их способности коагулировать белки (спирты, ацетон, некоторые кислоты, соли тяжелых металлов и др.) либо стабилизировать липиды и гели (четырехокись осмия, глутаровый альдегид, формалин, двухромовокислый калий и др.).

Для избирательной фиксации отдельных субклеточных структур используют более специфические фиксаторы (перманганат калия, двухромовокислый калий и др.). Качество фиксации в значительной степени зависит от pH и осмотического давления фиксирующего раствора. Оптимальным является pH 7,2—7,4, что соответствует физиологическим параметрам. Поэтому применяют буферные растворы (см.). Чаще применяют фосфатные или какодилатный буферы. Физиологическое осмотическое давление создают путем добавления осмотически активных веществ, например сахарозы или некоторых солей.

Имеется несколько методов химической фиксации: перфузионный, когда фиксатор вводят в ток крови; фиксация на месте, когда фиксатор вводят в ткань до ее иссечения: метод погружения иссеченных кусочков ткани в фиксатор. Для замедления аутолитических процессов, протекающих в иссеченных кусочках ткани до полной их фиксации, последнюю проводят при 2—5°.

После фиксации необходимо осуществить обезвоживание ткани. Этот процесс должен быть относительно быстрым, постепенным и вместе с тем обеспечить максимально полное удаление воды из образца, что достигается проведением подлежащей исследованию ткани через батарею спиртов или ацетонов восходящей концентрации (от 30 до 100%) в течение 1 часа.

Следующим важным этапом подготовки материала для электронной микроскопии является заливка (заключение) тканей в заливочные среды с целью получения блока, обладающего оптимальным сочетанием твердости и эластичности, позволяющим приготовить тонкий срез ткани (толщиной менее 100 нм), через который может пройти электронный луч. Первым заливочным материалом были метелметакрилат и бутилметакрилат. В настоящее время они почти не применяются, так как токсичны и легко возгоняются под пучком электронов, что приводит к выраженным артефактам и загрязнению электронного микроскопа. Наиболее широко для заливки тканей используют эпоксидные смолы, в основном аралдит и эпон, часто применяемые совместно. Менее распространены полиэфирные смолы (вестопал W) и водорастворимые заливочные смеси, из которых чаще пользуются гликольметакрилатом и дуркупаном. Однако ни одна заливочная среда не является химически инертной и в какой-то степени оказывает влияние на ткань; это необходимо учитывать при интерпретации результатов микроскопировання.

В последние годы широкое применение нашла заливка в так наз. компаунды, то есть в смесь определенных веществ: основы (мономера), отвердителя, придающего образующемуся полимеру прочность и твердость, пластификатора, обеспечивающего эластичность и упругость полимера, инициатора, диссоциирующего с образованием свободных радикалов, ускорителя, который, взаимодействуя с мономером, освобождает дополнительные активные радикалы, и катализатора, способствующего началу реакции полимеризации. В практике обычно используют компаунд, состоящий из основы, отвердителя, пластификатора и катализатора, роль которого может играть ускоритель или инициатор. Имеется достаточно большое количество способов пропитки ткани заливочными средами. Процесс пропитки обычно протекает при комнатной температуре или в термостате при t° 30—48° в течение 15—48 часов. Затем кусочки ткани переносят в маркированные желатиновые капсулы или специальные формы, наполненные заливочной смесью. Для полимеризации смеси капсулы на 48 часов помещают в термостат при t° 60° либо оставляют в течение 24 часов при комнатной температуре, затем на 24 часа их помещают в термостат при t° 48° и еще на 24 часа — при t° 60°. В результате полимеризации образуется блок, обладающий соответствующими свойствами.

Для получения ультратонких срезов толщиной 30—50 нм используются стеклянные или алмазные ножи. Алмазные ножи долговечнее стеклянных, но из-за высокой стоимости они не получили широкого распространения.

Для контрастирования срезов применяют вещества с большим атомным весом, такие как соли тяжелых металлов, интенсивно рассеивающие электроны. Ионы некоторых из этих веществ могут образовывать связи с кислородом и присоединяться к фосфатным группам нуклеиновых кислот; другие, особенно уранилацетат, помимо этого, действуют как универсальные красители на белки; свинец связывается с комплексами ткани и осмиевыми фиксаторами. Повышают контрастность и сами фиксаторы. Обычно проводят контрастирование ультратонких срезов или сочетают контрастирование кусочков и ультратонких срезов ткани, после чего их изучают в электронном микроскопе.

Химические методы фиксации и заливка материала имеют ряд недостатков. Так, при их использовании происходят химические изменения макромолекулярной структуры клеток; при фиксации и обезвоживании клетки и ткани теряют некоторые вещества; при взаимодействии ткани, фиксатора и заливочной среды может меняться локализация внутриклеточных структур. Поэтому интенсивно разрабатываются физические методы приготовления ткани для электронной микроскопии и особенно для электронной гистохимии (см.) и цитохимии (см.). Большая часть этих методов основана на очень быстром замораживании кусочков ткани.

Метод криоскалывания (замораживания—травления) позволяет избежать возникновения химических реакций при обработке ткани. Фрагменты тканей замораживают в хладоагенте со скоростью, превышающей 1000° в 1 сек. Объект помещают в вакуумную камеру и тем или иным способом раскалывают или разрывают. На поверхность скола наносят платиноуглеродное покрытие (реплику). Затем реплику очищают от органических остатков в растворе сильного окислителя, промывают в воде и помещают на сеточку для электронной микроскопии.

Для исследования поверхности биол. тканей используют методы реплик и оттенения. Наибольшее распространение получил метод приготовления реплик путем напыления в вакуумной камере углерода на поверхность образца ткани. Для контрастирования образовавшейся реплики на нее под острым углом напыляют электронно-плотные вещества (например, платину или платино-иридиевый сплав). При этом количество атомов металла значительно больше на той стороне контуров образца, которая ближе к источнику напыления; при исследовании в электронном микроскопе она выглядит неконтрастной. Противоположная поверхность контуров имеет мало атомов металла; в электронном микроскопе она контрастна и как бы оттеняет неконтрастную поверхность контура. Метод оттенения позволяет рассчитать высоту контуров исследуемого объекта, так как известны угод напыления, длина тени и увеличение, при котором производилось фотографирование реплики в электронном микроскопе.

Для изучения поверхности изолированных клеток и тканей служит сканирующая (растровая) электронная микроскопия. Одним из основных условий приготовления объекта для сканирующей электронной микроскопии является необходимость сохранения соответствующего поверхностного натяжения клеток во избежание их деформации. Поверхность изучаемой ткани промывают сбалансированными изотоническими забуференными солевыми растворами или безбелковыми культуральными средами с pH 7,3—7,4, подогретыми до t° 37°. Для фиксации обычно применяют изотонический раствор глутарового альдегида с последующей дофиксацией четырехокисью осмия. Ткань обезвоживают в спиртах или ацетонах, а затем высушивают методами замораживания—высушивания или перехода критической точки. Последний основан на использовании такого физического явления, как возникновение при определенных условиях критического состояния равновесия пара и жидкости. При этом методе ткань оказывается в газовой среде (то есть высушенной), что позволяет избежать повреждающего действия поверхностного натяжения. Для достижения высоких степеней разрешения. повышают электропроводность объекта, напыляя на него тяжелые металлы — золото, платину, серебро или их сплавы. Применяется также метод ионной бомбардировки в вакууме пластинки металла ионами инертного газа. «Выбитые» атомы металла оседают на поверхности объекта исследования. Для выявления внутритканевых и внутриклеточных структур применяют механические, термические, химические и другие методы.

Для электронной микроскопии микробов применяют сходные методы с учетом особенностей строения микробов, их размеров, осмотического давления и др. Так, особый подход осуществляется при электронной микроскопии вирусов. Изучение структуры вирусов затруднено из-за малых размеров и слабой рассеивающей способности вириона. На первых этапах электронной микроскопии вирусов эта трудность преодолевалась оттенением частиц при испарении тяжелых металлов в вакууме. Вплоть до конца 50-х годов 20 века методика оттенения вирусных частиц была основной при изучении вирусов в суспензиях. Чаще для этой методики использовали уран-238, платину, палладий или сплавы платины с палладием. Наибольшее распространение получил сплав платины с палладием в отношении 4:1. Зная заданный угол оттенения по длине образующейся тени, определяют высоту вирусной частицы и ее диаметр. Оттенение металлами исследуемого объекта при сочетании с криогенными методиками (замораживание—высушивание) позволяет получить важную информацию при изучении структуры вириона изометрических вирусов.

Широкое распространение получила методика негативного контрастирования вирусов с помощью вольфрамофосфорной кислоты (HзPW12O40), которая при подщелачивают едким калием или едким натрием (от значения pH Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание

Источник

Электронная микроскопия

Определение

Для подробного ознакомления с медицинской и исследовательской техникой основных мировых производителей оптических систем и сопутствующего оборудования посетите наш каталог или свяжитесь с нашими специалистами и получите полную профессиональную консультацию по любым, имеющимся у Вас, вопросам.

Основные понятия

Темнопольное изображение формируется рассеянными электронами (основной пучок электронов при этом отклоняют или экранируют) и используется при изучении сильнорассеивающих объектов (напр., кристаллов); по сравнению со светлопольным выглядит как негативное.

Трансмиссионная микроскопия

Трансмиссионная микроскопия реализуется с помощью трансмиссионных (просвечивающих) электронных микроскопов (ТЭМ; рис. 1), в которых тонкопленочный объект просвечивается пучком ускоренных электронов с энергией 50-200 кэВ. Электроны, отклоненные атомами объекта на малые углы и прошедшие сквозь него с небольшими энергетическими потерями, попадают в систему магнитных линз, которые формируют на люминесцентном экране (и на фотопленке) светлопольное изображение внутренней структуры. При этом удается достичь разрешения порядка 0,1 нм, что соответствует увеличениям до 1,5 х 106 раз. Рассеянные электроны задерживаются диафрагмами, от диаметра которых в значительной степени зависит контраст изображения. При изучении сильнорассеивающих объектов более информативны темнопольные изображения.

Разрешение и информативность ТЭМ-изображений во многом определяются характеристиками объекта и способом его подготовки. При исследовании тонких пленок и срезов полимерных материалов и биологических тканей контраст возрастает пропорционально их толщине, но одновременно снижается разрешение. Поэтому применяют очень тонкие (не более 0,01 мкм) пленки и срезы, повышая их контраст обработкой соединениями тяжелых металлов (Os, U, Pb и др.), которые избирательно взаимодействуют с компонентами микроструктуры (химическое контрастирование). Ультратонкие срезы полимерных материалов (10-100 нм) получают с помощью ультрамикротомов, а пористые и волокнистые материалы предварительно пропитывают и заливают в эпоксидные компаунды. Металлы исследуют в виде получаемой химическим или ионным травлением ультратонкой фольги. Для изучения формы и размеров микрочастиц (микрокристаллы, аэрозоли, вирусы, макромолекулы) их наносят в виде суспензий либо аэрозолей на пленки-подложки из формвара (поливинилформаль) или аморфного С, проницаемые для электронного луча, и контрастируют методом оттенения или негативного контрастирования.

Для анализа металлической фольги, а также толстых (1-3 мкм) срезов др. материалов используют высоко- и сверхвысоковольтные ТЭМ с ускоряющими напряжениями соотв. 200-300 и 1000-3000 кВ. Это позволяет снизить энергетические потери электронов при просвечивании образцов и получить четкие изображения, свободные от хроматической аберрации.

Растровая (сканирующая) микроскопия

Выбор регистрируемого вторичного излучения обусловлен задачей исследования. Основной режим работы РЭМ – регистрация вторичных электронов (ВЭ). Поскольку интенсивность эмиссии ВЭ сильно зависит от угла падения электронного луча на поверхность, получаемое изображение весьма близко к обычному макроскопическому изображению рельефа объекта, освещаемого со всех сторон рассеянным светом; иначе говоря, формируется топографический контраст. Эмиссия ВЭ отличается наибольшей интенсивностью по сравнению с другими вторичными излучениями. Кроме того, в этом режиме достигается макс. разрешение.

При исследовании неоднородных по составу поверхностей на топографическое изображение ВЭ накладывается дополнительное распределение яркостей, зависящее от среднего атомного номера Z вещества образца на каждом микроучастке (так называемый композиционный, или Z-контраст), который проявляется сильнее, если регистрировать не вторичные, а упругорассеянные электроны. Этот режим применяют при исследовании шлифов металлических сплавов минералов, композиционных материалов и других объектов, когда топографический контраст отсутствует и нужно установить композиционную неоднородность поверхности.

Тонкопленочные образцы (до 1 мкм) просвечиваются электронным лучом насквозь и прошедшие электроны регистрируются детектором, расположенным под объектом. Изображения, получаемые в этом режиме, иногда более информативны, чем обычные ТЭМ-изображения, т.к. свободны от хроматической аберрации.

В технических исследованиях используется также регистрация поглощенных электронов в сочетании с приложением рабочих напряжений к изучаемому транзистору или интегральной схеме. Это позволяет получать изображение, отвечающее распределению электрических потенциалов, и таким образом выявлять микродефекты в элементах схемы. При этом можно прерывать первичный электронный луч с высокой частотой и визуализировать прохождение по схеме высокочастотных сигналов.

С помощью соответствующих детекторных систем и спектрометров в РЭМ можно регистрировать электромагнитные излучения: катодолюминесценцию, тормозное и характеристические рентгеновские излучения, а также оже-электроны. Получаемые при этом изображения и спектры дают количеств, информацию о локальном элементном составе поверхностных слоев образца и широко применяются в материаловедении.

Для изучения структуры поверхности посредством РЭМ к образцу предъявляется ряд требований. Прежде всего, его поверхность должна быть электропроводящей, чтобы исключить помехи за счет накопления поверхностного заряда при сканировании. Кроме того, нужно всемерно повышать отношение сигнал/шум, которое наряду с параметрами оптической системы определяет разрешение. Поэтому перед исследованием на диэлектрические поверхности путем вакуумного испарения или ионного распыления наносят тонкую (15-20 нм) однородную пленку металла с высоким коэффициентом вторичной электронной эмиссии (Au, Au-Pd, Pt-Pd). Биологические объекты, содержащие, как правило, большое количество воды, перед нанесением покрытия необходимо зафиксировать специальной химической обработкой и высушить, сохранив естественный микрорельеф поверхности (сушка в критической точке с использованием сжиженных СО2 и N2O, хладонов или вакуумнокриогенными методами).

Перспективные направления развития

К ним относятся: повышение разрешающей способности ТЭМ и РЭМ; совершенствование способов подготовки образцов; разработка методов получения качественно новой информации и повышения чувствительности методов анализа с помощью спектрометрических систем; разработка методов компьютерной обработки полученных изображений с целью выявления содержащейся в них количественной информации о структуре объекта; автоматизация и компьютеризация ТЭМ, РЭМ и соединенной с ними аналитической аппаратуры.

Развитие способов подготовки образцов наиболее активно происходит в области электронно-микроскопического исследования структуры полимерных материалов и влагосодержащих объектов и связано преимущественно с разработкой криогенных методов (сверхбыстрое замораживание в струе хладона, прижим к металлическому блоку, охлаждаемому жидким Не, низкотемпературное замещение воды органическими растворителями, криоультратомия, криомикроскопия и др.). Эти методы позволяют избежать нарушений структуры и локального состава образцов, наблюдаемых при химической фиксации и нанесении электропроводных покрытий.

Такая же цель достигается и при использовании низковакуумного растрового электронного микроскопа (НВРЭМ), дающего возможность исследовать поверхность сильно увлажненных и даже живых объектов без предварительной химической или криогенной фиксации. В НВРЭМ объектная камера отделена от колонны РЭМ диафрагмой малого диаметра, пропускающей сканирующий электронный луч, но препятствующей проходу молекул газов в высоковакуумную часть колонны. Испускаемые поверхностью ВЭ собираются специальным кольцевым детектором, охватывающим объект. Использование НВРЭМ значительно расширяет исследовательские возможности биологов, почвоведов и материаловедов, позволяя в перспективе создать «полевой» вариант РЭМ.

Развитие компьютерной техники обусловило значительный прогресс в области математической обработки электронных изображений (компьютерная морфометрия). Разработанные аппаратно-программные комплексы позволяют: запоминать изображения, корректировать их контраст; расширять диапазон яркостей путем введения условных цветов; устранять шумы; подчеркивать границы микроучастков, выделять детали микроструктуры в заданном диапазоне размеров и оптической плотности; проводить статистическую обработку изображений и строить гистограммы распределения микрочастиц по размерам, форме и ориентации; реконструировать объемные изображения структуры композиционных материалов и иных объектов по микрофотографиям серийных срезов; реконструировать объемные изображения микрорельефа и строить профилограммы сечений по стереомикрофотографиям; рассчитывать локальные микроконцентрации элементов по элементно-селективным изображениям и спектрам; определять параметры кристаллич. решеток по электронограммам и др. Кроме того, встроенные в ТЭМ и РЭМ процессоры позволяют гибко управлять микроскопами, значительно снижают электроннолучевое повреждение образцов, повышают достоверность и воспроизводимость результатов анализа микроструктуры, облегчают труд исследователей.

Метод реплик

Рассмотрим метод реплик для изучения поверхностной геометрической структуры массивных тел. С поверхности такого тела снимается отпечаток в виде тонкой плёнки углерода, коллодия, формвара и др., повторяющий рельеф поверхности и рассматривается в просвечивающем электронном микроскопе. Обычно предварительно под скользящим (малым к поверхности) углом на реплику в вакууме напыляется слой сильно рассеивающего электроны тяжёлого металла (например, Pt), оттеняющего выступы и впадины геометрического рельефа.

Метод декорирования

Амплитудная электронная микроскопия

Методы амплитудной электронной микроскопии могут быть использованы для обработки изображений аморфных и других тел (размеры частиц которых меньше разрешаемого в электронном микроскопе расстояния), рассеивающих электроны диффузно. В просвечивающем электронном микроскопе, например, контраст изображения, т. е. перепад яркостей изображения соседних участков объекта, в первом приближении пропорционален перепаду толщин этих участков.

Фазовая электронная микроскопия

Для расчёта контраста изображений кристаллических тел, имеющих регулярные структуры (при рассеянии частиц на таких телах происходит дифракция частиц), а также для решения обратной задачи — расчёта структуры объекта по наблюдаемому изображению — применяются методы фазовой электронной микроскопии. Рассматривается задача о дифракции электронной волны на кристаллической решетке, при решении которой дополнительно учитываются неупругие взаимодействия электронов с объектом: рассеяние на плазмах, фононах и т. п. В просвечивающих электронных микроскопах и растровых просвечивающих электронных микроскопах высокого разрешения получают изображения отдельных молекул или атомов тяжелых элементов. Привлекая методы фазовой электронной микроскопии, можно восстанавливать по изображениям трехмерную структуру кристаллов и биологических макромолекул. Для решения подобных задач используют, в частности, методы голографии, а расчеты производят на ЭВМ.

Рассмотрим одну из разновидностей фазовой электронной микроскопии — интерференционную электронную микроскопию, которая является аналогом оптической интерферометрии. Электронный пучок расщепляется с помощью электронных призм, и в одном из плеч интерферометра устанавливается образец, изменяющий фазу проходящей сквозь него электронной волны. Этот метод позволяет измерить, например, внутренний электрический потенциал образца.

Лоренцова электронная микроскопия

Областью исследования лоренцовой электронной микроскопии, в которой изучают явления, обусловленные силой Лоренца, являются внутренние магнитные и электрические поля или внешние поля рассеяния, например, поля магнитных доменов в тонких пленках, сегнетоэлектрических доменов, поля головок для магнитной записи информации и т. п.

Количественная электронная микроскопия

Методы количественной электронной микроскопии — это точное измерение различных параметров образца или исследуемого процесса, например измерение локальных электрических потенциалов, магнитных полей, микрогеометрии поверхностного рельефа и т. д.

Иммуноэлектронная микроскопия

Иммуноэлектронная микроскопия(Immune electron microscopy) – это непосредственная визуализация взаимодействия антигена и антител с помощью электронной микроскопии. Иммуноэлектронная микроскопия впервые была предложена для вирусологических исследований Дж. Альмейда и А. Ватерсоном в 1969г.

Схема метода иммуноэлектронной микроскопии состоит в следующем:

1.Обследуемый материал, который проверяется на наличие искомого вируса, смешивается и инкубируется со стандартной иммунной сывороткой;

2.Комплекс вирус-антитело осаждается центрифугированием в подходящих для него режимах;

3.К ресуспендированному осадку добавляется контрастирующее вещество;

4.Полученный препарат исследуется под электронным микроскопом.

Если реакция положительна, выявляются характерные агрегаты, состоящие из вирусных частиц, соединенных между собой мостиками из антител. Порог чувствительности иммуноэлектронной микроскопии невысок: надежное выявление вируса осуществимо, когда его концентрация в исходном материале составляет 104— 106 частиц в мл. Преимущество метода заключается в возможности оценивать не только исход серологической реакции, но и идентифицировать ее морфологический субстрат, т. е. определить форму и размер вирусных частиц. При наличии препаратов вируса с известным содержанием частиц иммуноэлектронная микроскопия может применяться и для количественного определения антител в сыворотках. Для этого предлагается применять специальную систему учета интенсивности взаимодействия вируса и антител.

На начальных этапах работы с вирусными гепатитами иммуноэлектронная микроскопия широко применялась в исследованиях и диагностике. С использованием иммуноэлектронной микроскопии, в частности, были идентифицированы вирус гепатита А и вирус гепатита Е. На сегодняшний день существуют более практичные тесты для массовых исследований клинических материалов. Поэтому диагностика гепатитов с помощью иммуноэлектронной микроскопии постепенно утратила свое значение, но ее по-прежнему успешно используют для характеристики морфологически отличных от вируса антигенов или каких-либо ранее неизвестных вирусных агентов.

Источник