ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОНУКЛЕАРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
Выделение мононуклеаров периферической крови
2. Берут кровь. Переливают ее в коническую колбу, в которой находится дюжина стеклянных бус диаметром 2 мм. Колбу осторожно вращают кистью руки до тех пор, пока уже не будут слышны удары стеклянных бус друг о друга и о стенку колбы, т. е. пока кровь не свернется. (Не следует забывать об инфекционной опасности, которую представляет кровь человека.)
3. Разбавляют дефибринированную кровь равным объемом среды (PBS или BSS) при комнатной температуре.
4. С помощью пастеровской пипетки аккуратно наслаивают разбавленную дефибринированную кровь на градиент. Кончик пипетки загнут под углом 90° и отрезан алмазным ножом вблизи изгиба, чтобы избежать при наслаивании перемешивания градиента с кровью. (Можно поступить иначе. Вначале поместить дефибринированную кровь в чистую центрифужную пробирку, а затем подслоить под нее смесь метризоат — фиколл.)
5. Центрифугируют при 1500 g- в течение 15 мин., при комнатной температуре. (Во избежание перемешивания для остановки ротора центрифуги не следует пользоваться тормозом.)
6. Эритроциты и гранулоциты оседают на дно пробирки, а на границе раздела фаз находятся мононуклеарные клетки. Отсасывают прозрачный слой среды, расположенный непосредственно над опалесцирующим слоем мононуклеаров. Затем по всей площади сечения пробирки на границе раздела фаз собирают слой мононуклеаров. Клетки, прилипшие к стенкам, можно собрать кончиком пипетки. Мононуклеары переносят в чистую центрифужную пробирку.
7. Разбавляют взвесь мононуклеаров не менее чем четырехкратным избытком среды и тщательно перемешивают. С этого момента обработку клеток можно проводить при 4 °С. Чтобы сконцентрировать МПК, взвесь центрифугируют при 300 g в течение 10 мин.
Например, для разделения клеток крови человека в градиенте плотности используют 9%-ный (вес/объем) раствор фиколла, чтобы приготовить градиент с плотностью 1,078 г/мл. Для разделения клеток крысы готовят 14%-ный (вес/ объем) раствор фиколла, чтобы окончательно градиент имел плотность 1,087 г/мл. Фиколл растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре и интенсивном перемешивании. К 24 объемам растворенного фиколла добавляют 10 объемов 32,8%-ного (вес/объем) раствора метризоата натрия
В качестве градиента плотности для разделения клеток крови можно использовать коммерческий препарат фиколл-400 (“Sigma-Aldrich” Швеция) или смесь фиколла с рентгеноконтрастными веществами с высокой плотностью (урографин, верографин, уротраст или изопак).
Фиколл – это фирменное название синтетического высокомолекулярного сополимера сахарозы и эпихлоргидрина. В иммунологических исследованиях используют 6,1%-или 9%-ные растворы фиколла с молекулярной массой 400 кДа (Фиколл 400). Для приготовления раствора фиколла его растворяют в теплой дистиллированной воде.
Приготовление градиента плотности фиколл-верографина
1. Подготовка фиколла: 4.32 (8.64) г порошка фиколл-400 растворяют в 48 (96) мл дистиллированной воды.
2. Подготовка раствора рентгеноконтрастного вещества (в частности, верографина): 10.14 (20.28) мл 76% раствора верографина доводят дистиллированной водой до 21 (42) мл.
При отсутствии фиколл-400 градиент плотности можно приготовить только из одного рентгено-контрастного вещества. С этой целью 10 (20) мл 76% раствора верографина смешать с 43.1 (86.2) мл дистиллированной воды и добавить 0.45 (0.9) мл. фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Полученный при этом 14.3% раствор верографина имеет плотность 1.077 г/см и может быть использован в качестве градиента плотности.
Следует отметить, что при применении метода седиментации в градиенте плотности для выделения лимфоцитов из общей суспензии форменных элементов крови необходимо использовать кровь доноров или животных, освобожденную от фибрина.
Готовят 0,2%-иый раствор красителя в PBS, содержащий 3 мМ NaN3, при продолжительном перемешивании. Перед использованием раствор центрифугируют для удаления агломератов красителя.
Натрий-фосфатный буфер. Phosphate buffered saline, PBS
Для приготовления 1 литра однократного натрий-фосфатного буфера используют:
растворяют в 800 мл дистиллированной воды доводят рН до 7,4 соляной кислотой или гидроксидом натрия добавляют дистиллированной воды до 1 литра.
Источник
Способ выделения мононуклеаров из крови человека
Сущность изобретения: на 3 мл смеси (1 ч 76%-ного верографина и 4 ч 3,75%-ного поливинилпиролидона) наслаивают 6 мл цельной стабилизированной антикоагулянтом крови, затем проводят центрифугирование при 400g в течение 30 мин. После центрифугирования отсасывают пастеровской пипеткой слой мононуклеаров (плотное облачко над смесью). Выделенные клетки отмывают 1 раз не менее четырехкратным избытком питательной среды, затем мононуклеары концентрируют центрифугированием при 400 g в течение 10 мин.
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии.
Известен способ выделения мононуклеаров (лимфоцитов и моноцитов) из периферической крови человека, заключающийся в осаждении (седементации) эритроцитов желатином. Данный способ осуществляется следующим образом: 3%-ный раствор желатина в физиологическом растворе смешивается с кровью в соотношении 1: 3, после чего инкубируют при 37 o С в течение 30-40 мин, собирают надосадочную жидкость, полученные клетки осаждают центрифугированном (Понякина И. Д. Лебедев В.К. Метод розеткообразования для выделения Т- и В- иммунокомпетентных клеток. Возможности и ограничения. //Иммунология, 1983, N4, с. 10-20, Лебедев К. А. Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике. М. 1990, c.65.) Этот способ имеет ряд недостатков: Выделяются не только мононуклеары (лимфоциты и моноциты), но и гранулоциты (нейтрофилы, зозинофилы, базофилы), т.е. вся популяция лейкоцитов периферической крови; Популяционный состав выделяемых лейкоцитов зависит от времени расслаивания крови; В выделенной популяции лейкоцитов почти всегда присутствуют эритроциты.
Выход мононуклеаров соответствующим способом составляет 31-43% (Лимфоциты: Методы: Пер. с англ. /Под ред. Дж.Клауса. М. Мир, 1990, с.29-30), что указывает на недостаточную эффективность способа.
Известны также способы выделения мононуклеаров из периферической крови человека путем дифференциального центрифугирования в градиенте плотности (Boyum A.Separation of leucocytes from blood and bone marrow //Scand.S.Clin. lob. Invest. 1968.Vol.21, N1,p.90-109).
Один из таких способов выделения мононуклеаров состоит в следующем. На 3 мл смеси гипак-фиколла (10 ч 34%-ного гипака и 24 ч 8-9%-ного раствора фиколла на дистиллированной воде, плотность смеси доводится до 1,077 г/см 3 ) наслаивают 3 мл стабилизированной антикоагулянтом крови, разведенной физиологическим раствором в 2-3 раза, до объема 6-12 мл. Центрифугируют при 400g в течение 30-40 мин. После чего отсасывают пастеровской пипеткой слой клеток над смесью. Выделенные клетки отмывают (Лебедев К.А.Понякина И.Д.Там же стр. 66).
Фиколл обладает недостаточной вязкостью, что не позволяет эффективно проводить выделение мононуклеаров из цельной крови, а разведение крови в 2-3 раза во столько же раз уменьшает исходную концентрацию клеток и соответственно выход мононуклеаров.
Фиколл относительно дорогостоящий и дефицитный препарат, производимый фирмой Pharmacia.
Нами предложен способ выделения мононуклеаров из периферической крови путем дифференцированного центрифугирования цельной крови на градиенте верографин-поливинилпиролидона.
Предложенный способ осуществляется следующим образом.
Берут кровь. Для предотвращения свертывания в кровь при взятии добавляют антикоагулянты: гепарин (20 единиц на 1,0 мл крови или 0,1 мл 5%-ного этилендиаминтетрацетат натрия ЭДТА на 1,0 мл крови).
С помощью пастеровской пипетки аккуратно наслаивают цельную стабилизированную антикоагулянтом кровь в объеме 6 мл на градиент. Необходимо при наслаивании избегать смешивания градиента и крови.
Центрифугируют при 400g в течение 30 мин.
Эритроциты и гранулоциты оседают на дно пробирки, а на границе раздела находятся мононуклеарные клетки. По всей площади сечения пробирки на границе раздела фаз отсасывают пастеровской пипеткой слой мононуклеаров (плотное облачко над смесью). Клетки, прилипшие к стенке собирают кончиком пипетки. Мононуклеары переносят в чистую центрифужную пробирку.
Выделенные клетки отмывают 1 раз, для чего взвесь мононуклеаров разбавляют не менее четырехкратным избытком питательной среды (РПМИ-1640, раствор Хенкса, среда 199), тщательно перемешивают. Центрифугируют при 400g в течение 10 мин. Надосадок отбрасывают, а мононуклеары ресуспендируют раствором питательной среды.
Примечание. Возможен микрометод выделения мононуклеаров в центрифужной пробирке (объем 10-15 мл). При этом на 1 мл градиента наслаивают 2 мл цельной стабилизированной антикоагулянтом крови. Далее, как описано выше.
Основные сравнительные исследования проводили в группе здоровых лиц (20 человек).
Как видно из данных табл. 1, по проценту выхода клеток предлагаемый способ выделения мононуклеаров на градиенте плотности верографин-поливинилпиролидон не уступает прототипу и незначительно эффективнее аналога.
Также проведен клеточный анализ по числу эритроцитов и нейтрофилов на 100 клеточных элементов в выделяемой суспензии. При этом приготовленные мазки (для чего каплю суспензии переносят на предметное стекло) сушат на воздухе и фиксируют в этаноле в течении 5 мин, окрашивают по Романовскому-Гимза в течение 5 мин, промывают водой, высушивают на воздухе и проводят подсчет при иммерсионном увеличении объектива Х90 светового микроскопа (Лебедев К.А.Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике.-М. с.90).
Результаты представлены в табл.2.
Как видно из табл.2, в выделенной аналогом суспензии мононуклеаров содержится большое количество гранулоцитов и немного эритроцитов, в то же время в выделенной прототипом и предлагаемым способом суспензии мононуклеаров содержится ничтожное малое количество эритроцитов и гранулоцитов, что практически не отражается на результатах последующих работ с мононуклеарами. Следовательно, по сравниваемому показателю предлагаемый способ не уступает прототипу и намного эффективнее аналога.
Также проводили анализ трех способов по жизнеспособности выделенных клеток по поглощению ими трипанового синего на 100 клеток с выведением жизнеспособных клеток. Для чего к выделенным клеткам добавляли трипановый синий, тщательно перемешивали, инкубировали 2-3 мин, затем проводили подсчет клеток в камере Горяева.
Результаты представлены в таблице 3.
Как видно из табл.3, жизнеспособность клеток, выделенных как аналогом и прототипом, так и предлагаемым способом высокая и приближается к 100% что говорит почти о полной сохранности и целостности выделенных клеток.
Примеры реализации способа.
Пример 2. Выделяли мононуклеары непосредственно из крови донора, при этом соотношение кровь-смесь было 3:1 2:1 1:1. После окончания разделения образцы выглядели следующим образом: для соотношения кровь-смесь 3:1 при четко сформированном слое мононуклеаров в интерфазе толщина слоя составляла около 1-2 мм, что привело к загрязнению эритроцитами отобранного слоя мононуклеаров. При соотношении кровь-смесь 2:1 четко сформировался слой мононуклеаров, толщина интерфазы составила 5-6 мм, что позволило легко отобрать лимфоциты из интерфазы. При соотношении кровь-смесь 1:1 слой мононуклеаров был нечетко сформирован, толщина интерфазы составляла 10-12 мм, не было четкой границы между слоем мононуклеаров и разделяющей смесью, что привело к загрязнению плазмой и разделяющий смесью мононуклеаров. Таким образом, соотношение кровь-смесь 2:1 является оптимальным.
Пример 3. Донор М.21 год. Выделяли мононуклеары из крови тремя способами (аналогом, прототипом и предлагаемым способом), как описано выше. Определяли выход мононуклеаров в по сравнению с их содержанием в 1,0 мл крови, число эритроцитов и нейтрофилов на 100 клеточных элементов в выделенной суспензии, жизнеспособность выделенных клеток по поглощению ими трипанового синего на 100 клеток.
Результаты представлены в табл.4.
Как видно из примера 3, предлагаемый способ выделения мононуклеаров по основным показателям не уступает прототипу и эффективнее аналога.
Таким образом, предлагаемый способ отличатся от прототипа: По новизне: выделение мононуклеаров из крови человека в градиенте плотности разделяющей смеси, содержащей поливинилпиролидом в отличие от смеси, содержащей фиколл по прототипу.
По существеннным отличиям: при осуществлении способа сокращена одна операция разведение цельной крови физиологическим раствором, а также заменен дефицитный реактив Ficoll Pague производства фирмы Pharmacia на доступный реактив отечественного производства поливинилпиролидон. Возможность выделения мононуклеаров из цельной крови обеспечивается более высокой вязкостью смеси с поливинилпиролидоном по сравнению со смесью с фиколлом и упрощается процедура выделения. Кроме того, цельная кровь, обладая собственной высокой вязкостью, препятствует взаимной диффузии двух жидких фаз в процессе выделения, что улучшает все характеристики процесса. Использование неиммуногенного вещества поливинилпиролидон (вместо полисахарида бактериального происхождения фиколл, являющегося стимулирующим фактором для моноцитов и лимфоцитов) имеет положительные стороны для последующей работы с выделенными клетками.
По положительному эффекту: выделение мононуклеаров в градиенте плотности верографин-поливинилпиролидон по основным показателям (по выходу мононуклеаров, по содержанию гранулоцитов и эритроцитов на 100 выделенных клеток, по жизнеспособности выделенных клеток) не уступает выделению в смеси гипак-фиколл.
Выход мононуклеаров предлагаемым способом составляет 91,8 + 3,2% а по прототипу 92,4 + 4,2% Суммируя вышеизложенное, необходимо отметить, что предлагаемый способ выделения мононуклеаров из крови человека обладает высоким положительным эффектом. Данный способ может быть применен наряду с традиционными методами в медицине, в частности в иммунологии. ТТТ1
Способ выделения мононуклеаров из крови человека, включающий отбор крови, добавление антикоагулянта, нанесение пробы на градиент и центрифугирование в градиенте плотности в растворах, содержащих высокомолекулярное вещество, отличающийся тем, что цельную кровь наслаивают на градиент в соотношении кровь градиент 2:1, центрифугируют при 400 g в течение 30 мин, при этом градиент представляет собой смесь верографина с поливинилпирролидоном, взятых в соотношении 1:4 (по объему).
Источник
Для чего служит этап отмывки мононуклеарных клеток
Материалы
— 1.077 g/ml Ficoll-Hypaque (Pharmacia) или Histopaque-1077 (Sigma)
— кровь (обычная, мобилизированная, пуповинная, костный мозг) в пробирках или контейнерах с антикоагулянтом (гепарин, ЭДТА, ACD)
— PBS (phosphat-buffered saline)
— любая культуральная среда с 5-10% сыворотки.
— центрифужные пробирки (на 15- и/или 50 мл.)
— центрифуга
———
ссылки
Boyum A. Scand J Clin Lab Invest 1968 sup. 21 77-89
Boyum A. Lymphology 1977; 10 71-76
модификации
|
