Фотометрия в лабораторной диагностике

В дальнейшем, для простоты в статье будет рассматриваться только горизонтальная фотометрия в проходящем свете (то есть измерение оптической плотности растворов).

Итак, все начинается с простейшей схемы прибора, который используется для фотометрической детекции.

Схема простейшего фотометра

В простейшем случае световой поток от источника света налетает на исследуемый раствор. После прохождения через раствор ослабленный световой поток попадает на фотодетектор. Поскольку условия, при которых проводится измерение подбираются так, что вся оптическая плотность раствора обусловлена присутствием одного вещества, то измеряя оптическую плотность мы можем, в конечном итоге, определять концентрацию этого вещества.

Физические основы фотометрии

Физический принцип, лежащий в основе данного процесса, называется законом Бугера-Ламберта-Берра.

Таким образом, если принять, что в условиях измерения которые мы можем стандартизировать величина e_λ известна, толщина поглощающего слоя известна и вообще то определяется нами, величины I и I₀ выясняются в процессе измерения, следовательно зная все эти показатели в конечном счете можно вычислить концентрацию исследуемого вещества.

Прологарифмировав нашу исходную формулу по основанию 10, получим:

Далее путем нехитрых преобразований получаем:

Величина lg I₀/I называется оптической плотностью и как правило обозначается буквами A или D или OD. Поскольку величины e_λ и l являются постоянными при каждом измерении, то оптическая плотность линейно зависит только от концентрации измеряемого вещества в растворе, следовательно измеряя оптическую плотность мы можем определить концентрацию.

Проведение калибровки

Как уже было сказано выше оптическая плотность и концентрация определяемого вещества связаны линейной зависимостью.

Отсюда следует, что, зная уравнение прямой для данной зависимости мы можем по любой известной оптической плотности узнать концентрацию интересующего нас вещества.

Для того, чтобы узнать это уравнения проводится процедура калибровки.

На практике если калибровка делается вручную процедура заключается в построении так называемой калибровочной кривой (которая в случае фотометрического измерения чаще всего является прямой линией :).

Для построения линейной зависимости требуется как минимум две точки.

Для начала берется раствор с известной концентрацией вещества (калибратор), которое мы собираемся измерять. После проведения соответствующей химической реакции измеряется оптическая плотность получившейся реакционной смеси, при этом на графике по оси абсцисс откладывается концентрация вещества в растворе, а по оси ординат получившаяся оптическая плотность. Таким образом мы получаем первую точку на графике. Для получения второй точки можно использовать раствор с другой концентрацией, но на практике исходят из предположения, что раствор с нулевой концентрацией обладает нулевой оптической плотностью и в качестве второй точки просто берется начало координат (на самом деле это не так, но это преодолевается при помощи специальных процедур настройки прибора), что позволяет проводить калибровку большинства показателей биохимии по калибратору только с одним уровнем концентрации.

Таким образом получается график, используя который, можно по известной оптической плотности определить концентрацию вещества в растворе.

Калибровочный график

В современный лабораториях калибровку как правило вручную не проводят, это делается автоматически биохимическими анализаторами или другими приборами с фотометрической детекцией на борту.

Суть остается той же за исключением того, что прибор делает расчет для нахождения функции, описывающей калибровочный график, и далее использует ее для расчета концентраций. Калибровочный график при этом строится исключительно для удобства пользователя.

В общем виде функция, описывающая прямую линию, выглядит следующим образом:

Поскольку значение b при помощи настроек прибора приводится к значению ноль, то вся процедура калибровки сводится к нахождению фактора калибровки, при умножении на него оптической плотности анализатор в дальнейшем вычисляет все концентрации интересующего нас вещества.

Выбор длинны волны

При проведении фотометрического измерения источник света как правило генерирует световой поток по всему видимому (и не только) спектру длин волн. Источники света современных биохимических анализаторов как правило охватывают диапазон от ближнего ультрафиолета и до всего видимого красного диапазона.

Как уже говорилось ранее молярный коэффициент поглощения является функцией от длинны волны и следовательно исследуемый раствор будет обладать разными коэффициентами поглощения на разных длинах волн. При этом на практике, в основном для того, чтобы избежать влияния неспецифических факторов, измерения проводится на какой-то одной определенной длине волны.

Для выбора длины волны на заре лабораторной диагностики существовало такое наивное эмпирическое правило: если мы видим, что раствор окрашен в какой-либо цвет, то нужно выбрать для измерения длину волны по цвету, отличающуюся от цвета раствора.

Помимо того, что данный подход слишком упрощен, он еще и не применим к ультрафиолетовой части спектра.

Более научный подход заключается в построении графика зависимости оптической плотности раствора от длинны волны.

Поскольку измеряемые биохимическими методами биологические вещества, как правило не обладают достаточной собственной оптической плотностью, для их детекции используются различные специфические химические реакции, которые в итоге и генерируют вещества обладающие достаточной оптической плотностью, в этом случае говорят, что реакция идет с увеличением оптической плотности. Либо в процессе реакции такие вещества расходуются, тогда реакция идет с уменьшением оптической плотности.

Для выбора длинны волны для конкретного метода проводится построение двух графиков зависимости оптической плотности раствора от длинны волны:

После построения графика берется длинна волны, на которой разность оптической плотности у субстратов и продуктов реакции максимальна.

Для примера можно взять так называемый оптический тест Варбурга.

Данная реакция широко используется как индикаторная многими производителями для определения ЛДГ, АЛТ, АСТ, КФК, КФК-МБ, мочевины и глюкозы (гексокиназным методом).

Данная реакция заключается в обратимом окислении никотинамидадениндинуклеотида (НАД) под действием какого-нибудь фермента из класса оксидоредуктаз.

В результате мы имеем два графика для окисленной и восстановленной формы НАД одна из которых играет роль субстрата, а другая продукта реакции в конкретных биохимических наборах.

Оптический тест Варбурга

В результате анализа данного графика видим, что наибольшая разница оптической плотности между этими двумя формами находится в районе 340 нм. Именно эта длинна волны и используется для определения перечисленных выше биохимических показателей.

Устройство, которое преобразует свет от источника в световой поток с какой-то одной определенной длинной волны называется монохроматор.

Основные типы монохроматоров:

Таким образом, если включить в нашу схему простейшего фотометра монохроматор (например призму), то она будет выглядеть следующим образом.

Фотометрия на определенной длинне волны

Бихроматическое измерение

В лабораторной диагностике зачастую возникают ситуации, когда нужно провести измерение оптической плотности на двух длинах волн. Такие измерения называются бихроматическими.

Теоретическое обоснование проведения такого измерения следующее: в биологических жидкостях присутствует огромное количество различных веществ, некоторые из которых могут обладать собственной оптической плотностью или вступать в неспецифические реакции с компонентами диагностический наборов, при этом зачастую биологические жидкости могут проявлять свойства коллоидных растворов и не только поглощать, но и рассеивать свет. Поэтому для того, чтобы учесть влияние этих интерферирующих факторов оптическая плотность рассчитывается как разность между оптической плотностью на основной длине волны (о ней уже шла речь выше) и другой длине волны, которая обычно называется опорной или отсекающей, оптическая плотность на которой, как считается, обусловлена неспецифическими факторами.

Приведенная в предыдущем разделе конструктивная схема фотометра называется монохроматической. Исторически она возникла первой, но в современных машинах практически не используется.

Монохроматической она называется потому, что в каждый конкретный момент времени считывание оптической плотности проводится только на одной длине волны и для того, чтобы провести бихроматическое измерение нужно, например, физически поменять светофильтр или изменить угол поворота призмы или дифракционной решетки. В некоторых вариантах проведения фотометрии это неприемлемо (например, кинетические измерения). Поэтому в дальнейшем была разработана полихроматическая схема детекции, которая позволяет считывать оптическую плотность раствора на нескольких длинах волн. Этого было достигнуто разложением полихроматического света в спектр уже после прохождения через поглощающий раствор (то есть перенесением монохроматора за кювету с образцом) и установкой сразу нескольких фотодетекторов для разных длин волн.

Полихроматическая схема детекции

Такая схема позволяет проводить измерение на нескольких длинах волн одновременно.

Методы расчета концентрации

Существует несколько способов расчета концентрации раствора по полученной оптической плотности.

Наиболее простым является метод расчета по конечной точке.

При таком методе график зависимости оптической плотности от концентрации измеряемого вещества выглядит следующим образом:

Конечная точка

При этом после небольшого времени задержки (lag-time), связанного с перемешиванием биоматериала с компонентами диагностического набора и их термостатированием происходит резкое возрастание оптической плотности до определенного уровня, пропорционального концентрации определяемого вещества, после выхода оптической плотности на «плато» дальше она уже практически не изменяется (достигает конечной точки).

Данный метод не пригоден для измерения активности ферментов, а биохимическими методами измеряется именно активность ферментов, а не их концентрация.

Для измерения активности ферментов используется кинетический метод расчета концентрации график которого выглядит примерно так:

Кинетика

После некоторого времени задержки, обусловленного теми же факторами, происходит непрерывное изменение оптической плотности (на графике нарастание) с постоянной скоростью, которая и определяет активность фермента. При этом скорость реакции определяется как тангенс угла наклона графика изменения оптической плотности. Чем круче изменяется оптическая плотность, тем больше активность фермента.

Данные два метода являются основными.

Помимо них так же еще существует турбидиметрический метод измерения, при помощи которого измеряются высокомолекулярные вещества, обладающие антигенной природой, но данный метод уже основан на других физических принципах и к фотометрии не относится.

Источник

Для ряда аналитов сложилась система промышленного приготовления рабочих калибраторов, состав которых сверяется с созданными международными (или национальными) организациями эталонами. Надежное выполнение лабораторных анализов предполагает, что свойства вещества «прослежены» от международного эталона до конкретного материала, по которому калибруется метод в данной лаборатории.

Калибровка обязательна при налаживании метода. Частота ее проведения в последующем зависит от конкретных обстоятельств. Она необходима при смене реактивов, а также если внутрилабораторный контроль качества исследований свидетельствует о наличии существенных погрешностей.

Следует иметь в виду, что результат калибровки может зависеть от качества калибровочного материала. Иногда промышленные фирмы предлагают калибровочные материалы пригодные только для одного метода, чаще всего для того, который служит основой набора реагентов, который комплектуется данным калибровочным материалом. Иногда эти материалы являются лишь имитаторами калибраторов, способными только в совершенно определенных условиях развивать окраску, похожую на ту, которая развивается при выполнении анализа. Изменение условий или использование таких «калибраторов» для других методов может быть источником грубых ошибок.

Принципы калибровки. Правила построения калибровочного графика.

В простейшем случае, когда работа выполняется вручную, строится калибровочный график. Для этого на одной оси откладывают концентрацию аналита, а на другой размер непосредственно полученных значений (например, оптической плотности). Соединив точки, отражающие реально выявленную зависимость между измеренными значениями и концентрацией аналита, получают линию, по которой далее ведут расчет. Задача значительно облегчается, если заранее известно, что линия должна быть прямой. Прямая линия (линейный калибровочный график) облегчает интерполяцию, т.е. определение концентраций, которые соответствуют значениями оптической плотности между калибровочными точками. Если точки не оказываются в точности на прямой линии, калибровочную линию проводят по линейке на глаз, так, чтобы линия была по возможности равно удалена (или одинаково близка) по отношению ко всем точкам. Этим достигается усреднение погрешности измерения.

Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).

Источник

Построение калибровочных графиков и их применение.

Онлайн-конференция

«Современная профориентация педагогов
и родителей, перспективы рынка труда
и особенности личности подростка»

Свидетельство и скидка на обучение каждому участнику

Построение калибровочных графиков и их применение.

Для построения калибровочного графика готовят серию стандартных растворов, охватывающих диапазон измеряемых концентраций исследуемого вещества согласно методике.

Калибровочный график строят по 5-6 сериям шкал; количество концентраций в каждой шкале должно быть не мене 5. Резко отличающиеся значения оптической плотности не учитывают. Из остальных рассчитывают среднее арифметическое значение для каждой концентрации и строят график зависимости оптической плотности от концентрации вещества (рисунок 14).

Примерный размер графика 20-25×30 см; прямая должна проходить через начало координат под углом приблизительно 45°. В идеальном случае все точки располагаются на прямой, обычно часть точек располагается на прямой, часть выше и ниже ее, точки как бы чередуются.

На графике должны быть указаны условия фотометрирования: номер светофильтра или длины волны (нм); размер кюветы (мм); время фотометрирования. Кроме того, должна быть указана дата построения калибровочного графика. Калибровочный график необходимо периодически проверять по 2-3 концентрациям.

Наиболее распространенными приборами являются фотоэлектроколориметр ФЭК-56М, колориметр фотоэлектрический однолучевой КФО, колориметр фотоэлектрический концентрационный КФК-2 (рисунок 15), КФК-2МП с микропроцессорной системой «Электроника» и спектрофотометр СФ-46 (таблица 2).

Спектральный диапазон, нм

Надежность результатов измерений при работе на фотоэлектроколориметрах и спектрофотометрах обеспечивается, правильной установкой и эксплуатацией приборов. Поэтому приступать к измерениям можно только после тщательного ознакомления с описанием устройства прибора и правил его эксплуатации.

Прямое фотометрическое определение железа

Большие содержания железа

Построение калибровочного графика для прямого

фотометрического определения железа

Источник

ОСНОВЫ МЕТОДА КАЛИБРОВОЧНОГО ГРАФИКА

Калибровочные графики используются только в физических и физико-химических методах анализа. На фоне победных реляций физиков-теоретиков об успешном описании физических и физико-химических процессов возникает вопрос: если все так хорошо изучено, то зачем вообще нужны калибровочные графики? Они нужны для того, чтобы учесть все факторы, влияющие на процесс анализа, которые теоретически учесть довольно трудно. К факторам такого рода можно отнести сложную кинетику химической реакции, аномальные константы равновесия, коэффициенты активности т.п. Из этого следует, что легче построить калибровочный график, чем заниматься утомительными поправками к теоретическим прогнозам.

Принцип построения калибровочного графика несложен. Готовятся несколько стандартных растворов (5-6 растворов, реже меньше 4) с известным содержанием определяемого вещества. В каждом стандартном растворе измеряется аналитический сигнал прибором, который используется в данном виде анализа. По результатам измерений строится график в координатах аналитический сигнал – содержание вещества в стандартном растворе. Построенный график является калибровочным. Далее все становится еще проще: проводятся измерения в анализируемом растворе, в котором следует узнать концентрацию определяемого вещества. Получив величину аналитического сигнала, с помощью калибровочного графика, находится концентрация, которая соответствует этому сигналу. На этом процедура анализа считается завершенной.

Простота простотой, но надо разъяснить некоторые технические детали построения калибровочного графика. Когда говорят о калибровочном графике, то всегда (за малым исключением) подразумевают прямую линию. Прямая линия является либо естественной функцией аналитического сигнала от концентрации, либо экспериментальные данные подвергаются линеаризации, чтобы в итоге калибровка стала прямой. Отсюда возникает вопрос: а почему калибровка должна быть представлена в виде прямой? В наше время, когда компьютер стоит на каждом столе, не слишком ли примитивно строить прямые? Тут дело обстоит не столько в математической обработке результатов, сколько в потребности лишний раз убедиться в том, что калибровочная прямая подтверждает ожидаемый физико-химический закон. Оценку этого легче проводить по параметрам прямой, чем по виду кривой линии. Таким образом, если при построении калибровочной прямой мы лишний раз убеждаемся, что это действительно прямая, то со спокойной совестью мы можем констатировать ожидаемое течение реакции и нормальное функционирование прибора.

Приведем пример построения калибровки для спектрофотометрического метода анализа.
Оптическая плотность окрашенных растворов находится в линейной зависимости от концентрации окрашенного вещества в растворе. Об этом свидетельствует закон Бугера-Ламберта-Бера:

ε – молярный коэффициент погашения;

C – молярная концентрация раствора, моль/л;

l – толщина кюветы, см.

Отсюда вывод о виде калибровочного графика отсюда однозначен: график должен быть прямой линией и исходить из нуля.
Действительность же приносит сюрпризы. Во-первых, калибровки часто не исходят из нуля. Во-вторых, калибровочный график имеет концентрационные пределы линейности. Со второй особенностью разбираться можно долго и безрезультатно, поэтому примем этот факт и смиримся с ним, используя только линейную область калибровки. С первым сюрпризом дело обстоит несколько проще. Причин, которые мешают исходить калибровочной прямой из нуля обычно две. Первая причина несерьезна и легко устранима. Она состоит в том, что кюветы имеют чуть разные размеры или дефекты стекла. Разность эта невелика и может достигать 0,001-0,002 единиц оптической плотности. Измерить эту разность несложно, достаточно залить в кюветы фоновый раствор, не содержащий анализируемого вещества, и измерить оптическую плотность растворов друг относительно друга.

Если же калибровочная прямая не исходит из нуля на более значительную величину, чем предполагает разность размеров кювет, то может идти речь о частичном разложении реактива, который вызывает окраску раствора с определяемым веществом. Иными словами, в результате разложения реактива образуется небольшое количество вещества, которое вступает в реакцию с определяемым веществом. Конечно, можно закрыть на это глаза, но лучше этого не делать и подвергнуть реактив очистке. Зачем это нужно? А делать это нужно для того, чтобы исключить побочные реакции, которые существенно снижают надежность последующих анализов.

Существует еще одно правило, которое следует неукоснительно соблюдать: не производить аналитические определения за пределами калибровочного графика. Это ни к чему хорошему не приводит, так как есть большой риск получения большой систематической ошибки. Но тут есть радующее душу исключение. Если калибровочная прямая исходит из нуля (если она теоретически должна из него исходить), то можно производить определения ниже нижней границы калибровки. Если же прямая должна исходить из нуля, но она из него не исходит, то риск ошибиться при определении малых концентраций вещества неизбежно многократно возрастает!

Тогда закономерно возникает вопрос: а что делать, если концентрация в анализируемой пробе находится за границами калибровочного графика? Ответ будет незатейлив: берите меньшую аликвоту для анализа пробы с высоким содержанием вещества и концентрируйте пробу для анализа с малым содержанием определяемого компонента.

Источник

Методические указания для обучающихся к практическому занятию для аудиторной работы, тема: «Построение калибровочных графиков»

ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развтию»

Кафедра Клиничео-лабораторной диагностики

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ для аудиторной работы

Тема: «Построение калибровочных графиков»

Утверждена на кафедральном заседании

(межкафедральной методической конференции)

«_____»__________________ 2010 г.

к. м.н., доцент _______________________

к. м.н., доцент _____________________

Учебная цель: Познакомить курсантов с правилами построения калибровочных графиков, методами расчета контрольных точек и способам проверки построенного графика.

На практических занятиях: специально разработанные задачи для закрепления на практике полученной теоретической базы.

Практические навыки, которыми должен владеть курсант

Вычисление точек для построения калибровочного графика двумя способами

Знание методики проверки калибровочного графика

Знание основных принципов использования калибровочного графика

На цикле общего усовершенствования определить базовый уровень знания предмета, оценить умение курсанта находить наиболее верную тактику использования калибровочного графика в сложных ситуациях, которые могут создаться на рабочем месте.

На цикле ППС подробно разобрать требования к калибровочным материалам и правила их приготовления. Отработать на специальных примерах принципы построения калибровочного графика и способы расчета калибровочных растворов, и способы проверки правильности построения калибровочной кривой. В конце занятия проверить степень усвоения разобранной темы и подробнее остановиться на вызвавших затруднение вопросах.

При подготовке к занятию прочитать всю доступную литературу по данной теме, а в методическом кабинете проработать разработанное на кафедре учебное пособие. Самостоятельно используя стандартные наборы различных производителей рассчитать разными способами точки для построения калибровочной кривой, ответить на все контрольные вопросы которые приводятся в конце данного пособия. Если возникли какие-либо затруднения сформировать логически вопрос и задать его преподавателю на практическом занятии либо в начале, либо по ходу разбора темы.

1. Количественные проблемы биохимии, М. 1983

2. Унификация лабораторных методов исследования. Стандартизация качества унифицированных клинических лабораторных методов исследования, М., 1981.

3. Лабораторное дело, 1977, №4, 253.

4. Камышников по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2т. т.1 – Мн.: Беларусь, 2000. – 495 с.: ил.

В основе всех колориметрических методов положено светопропускание и светопоглащение. Приборы, используемые в фотометрическом анализе позволяют определить оптическую плотность и процент светопропускания. Но в отделение выдается результат исследования не в единицах оптической плотности, а в единицах концентрации. Экстинция исследуемого образца сравнивается с экстинцией образца компонента с точно известной концентрацией. Расчеты ведут по формуле или калибровочному графику.

Калибровочный график – это графическое изображение связи между измеряемой величиной экстинцией и концентрацией вещества.

Методы исследования, в основе которых лежит сравнение с образцом являются методами сравнения и их точность зависит от точности приготовления калибровочных растворов и чистоты веществ.

Характеристика калибровочных материалов

Для получения воспроизводимых, контролируемых, статистически достоверных и сравниваемых результатов существует система измерений, включающая методологию и соответствующие вещества контролируемого состава. Экспертная группа по номенклатуре качественного контроля предлагает разделить калибровочные стандарты на группы:

— первичные – в которой масса стандартного вещества определяется взвешиванием;

— вторичные – содержание компонентов определяется аналитическим методом.

Требования к первичному стандарту

1. Вещество должно быть стабильным.

2. Вещество должно иметь точно установленный состав.

3. Вещество должно иметь высокий эквивалентный вес, чтобы при взвешивании ошибка была минимальной.

4. Вещество не должно изменяться при очистке, сушке и т. д.

Этим требованиям в настоящее время соответствуют не все вещества, в основном неорганические.

В качестве калибровочных материалов могут использоваться вещества различной природы и степени чистоты, в зависимости от поставленных задач.

Правила при приготовлении калибровочных растворов

1. Используемое вещество должно быть максимально возможной чистоты с максимум содержания основного вещества – более 99,9 %. Чем чище вещество, тем оно стабильнее.

Например: есть вещества степени чистоты хч, чда, ч. Берем хч.

2. Навеска отвешивается с большой точностью на аналитических весах (в ряде случаев допустимо использование торсионных весов), но всегда в таре, с которой вещество можно смыть растворителем.

3. Навеска должна быть довольно большой, чтобы повысить точность взвешивания. Если по методике требуется слабый раствор, то готовят более концентрированный, а затем его разбавляют. Чем больше навеска – тем выше точность.

4. Иногда в методике есть специальные указания (например: высушить до постоянного веса и т. д.). Сушить можно прокаливанием, в термостате, в эксикаторе, выветриванием. Нужно посмотреть по химическому справочнику термоустойчивость вещества. Обязательно взвешивание до и после высушивания.

Нельзя готовить калибровочные растворы из гигроскопичных веществ.

Альбуминосодержащие калибровочные растворы следует применять в случаях, когда это указано в методике или если необходимо проверить влияние белка на надежность метода.

Диапазон стандартных растворов

То есть концентрации веществ должны быть адоптированы к пределам нормы и чувствительности метода, и график обычно включает не менее 4-5 точек.

-Х—— средняя величина

При проверке надежности метода, кроме того, следует определить:

-прямолинейность выше максимальной точки калибровочной кривой;

-прямолинейность между нулевой точкой и минимальной на калибровочной кривой. Для этого готовят еще по 3 точки (эквидистантные концентрации).

Для каждой выбранной точки готовят калибровочный раствор, который обрабатывают по методике в параллельных пробах (не менее 2-3), на график наносится среднее значение.

Общие требования

1. Разведение стандартного раствора готовят в арифметической, а не геометрической прогрессии, выдерживая 1 шаг: 0,1 мг, 0,2 мг, 0,3 мг и т. д.

2. При измерении оптических плоскостей следует учитывать оптическую плотность реактивов, иначе точка не пройдет через 0. Для этого колориметрируют против контроля, содержащего все реактивы.

Оптическую плотность, полученную для калибровочных растворов, наносим на систему координат. Лучше всего пользоваться миллиметровой бумагой достаточно большого размера. По оси ординат откладывается плотность, по оси абсцисс – концентрация. Масштаб выбирается произвольно: для концентраций – чтобы можно было считать с точностью, соответствующей практическим требованиям с учетом пределов нормы и чувствительности метода; для экстинции – учитывая цену деления прибора. Оптимально, когда наклон кривой к оси абсцисс проходит под углом 450. При малом масштабе угол будет больше и кривая более крутая, при большем масштабе – кривая проходит более полого.

Если в пределах выбранных концентраций растворы соответствуют закону Ламберта-Бера, то график проходит через 0 точку и имеет вид прямой.

Всегда ли кривая в выбранном диапазоне концентраций проходит через точку 0? Нет, не всегда, даже если кривая правильная. Это может быть: 1. если реакция при больших и малых концентрациях протекает не строго стериохимически; 2. если исследование ведется не в монохромном свете. Надо перейти на другой прибор.

НО ВСЕГДА НАДО РАБОТАТЬ НА ЛИНЕЙНОМ УЧАСТКЕ КРИВОЙ.

Иногда это невозможно. Например, при определении белка по Лоури, где кривая очень быстро выходит на плато. В этом случае строят графическую калибровочную кривую. Кроме основных калибровочных растворов, проходящих по прямолинейному участку, берут не менее 10 стандартных растворов, проходящих по прямолинейному участку, берут не менее 10 стандартных растворов, соответствующих пологому участку. Т. е. на пологом участке будет много точек.

Приготовление калибровочных растворов

Из основного калибровочного вещества готовят ряд стандартных проб. Они могут быть приготовлены 2-мя способами, в зависимости от биохимии метода.

1 способ: Необходимая концентрация стандартного раствора обеспечивается за счет различных объемов одного и того же маточного (основного) стандартного раствора.

Источник