Для чего нужно покровное стекло в биологии

Покровное стекло и предметное стекло

Содержание Значение покровного стеклаВиды покровных стеколПредметные стекла и их виды Микроскопирование — важнейшая и неотъемлемая часть клинической диагностики. Для приготовления и исследования препаратов в лабораториях необходимо иметь набор покровных и набор предметных стекол. Значение покровного стекла Лабораторный микроскоп — дорогостоящий прибор, и окуляр является его важнейшей частью. Для предохранения линз от попадания исследуемых жидкостей требуются защитные приспособления. Толщина покровного слоя не должна превышать 0,15-0,4 мм. От наличия этой деликатной детали зависит также и качество исследования. Препарат, защищенный сверху, не высыхает и не содержит пузырьков воздуха. Еще один ответ, зачем нужно использовать покровное стекло — применение счетных камер (Горяева, Фукса-Розенталя). Несмотря на наличие в лабораториях современных анализаторов, эти надежные способы исследований не утрачивают актуальности. Виды покровных стекол В каталоге Апекслаб https://apexlab.ru/category/ представлены все существующие стекла под микроскоп. Покровные стекла имеются в размерах: 18х18;20х20;22х22;24х24;24х32;24х40;24х50;24х60. Широко употребляются стекла покровные 24 24. Это универсальный размер, но во многих случаях требуются покровные стекла, размеры которых больше или меньше. Выбор зависит от конкретной задачи, решаемой в лаборатории. Оборудование и расходные материалы, купить которые можно на сайте Апекслаб, строго соответствуют требованиям ГОСТ. Предметные стекла и их виды Для исследования под микроскопом нативный или окрашенный препарат необходимо нанести на поверхность, которая не искажает и не скрадывает прямые и преломленные световые лучи. Очень важно, чтобы в поле зрения не попали посторонние артефакты — царапины, сколы, жировая пленка. В работе требуются разные виды предметных стекол: с лункой;с двумя лунками;с обрезанным краем;со шлифованным краем;с матовой полосой для записи. Эти качества могут сочетаться. Так, например, в каталоге имеются стекла предметные со шлифованными краями и лункой. Возможны и другие комбинации. При наличии специальной матовой полосы облегчается маркировка предметных стекол. Это удобно при создании музея препаратов и для ежедневной маркировки анализов. Даже у школьников не возникает вопросов, зачем нужно использовать предметное стекло. Это обязательная комплектующая деталь любого микроскопа. Для сложных исследований крайне важно, чтобы покровное стекло и предметное стекло отвечали всем требованиям международного стандарта качества ISO 9001:2000. Именно такая продукция продается на сайте Апесклаб.

Апекслаб, ООО Лабораторное оборудование и материалы

Содержание

Микроскопирование — важнейшая и неотъемлемая часть клинической диагностики. Для приготовления и исследования препаратов в лабораториях необходимо иметь набор покровных и набор предметных стекол.

Значение покровного стекла

Лабораторный микроскоп — дорогостоящий прибор, и окуляр является его важнейшей частью. Для предохранения линз от попадания исследуемых жидкостей требуются защитные приспособления. Толщина покровного слоя не должна превышать 0,15-0,4 мм. От наличия этой деликатной детали зависит также и качество исследования. Препарат, защищенный сверху, не высыхает и не содержит пузырьков воздуха.

Еще один ответ, зачем нужно использовать покровное стекло — применение счетных камер (Горяева, Фукса-Розенталя). Несмотря на наличие в лабораториях современных анализаторов, эти надежные способы исследований не утрачивают актуальности.

Виды покровных стекол

В каталоге Апекслаб https://apexlab.ru/category/ представлены все существующие стекла под микроскоп. Покровные стекла имеются в размерах:

Широко употребляются стекла покровные 24 24. Это универсальный размер, но во многих случаях требуются покровные стекла, размеры которых больше или меньше. Выбор зависит от конкретной задачи, решаемой в лаборатории.

Оборудование и расходные материалы, купить которые можно на сайте Апекслаб, строго соответствуют требованиям ГОСТ.

Предметные стекла и их виды

Для исследования под микроскопом нативный или окрашенный препарат необходимо нанести на поверхность, которая не искажает и не скрадывает прямые и преломленные световые лучи. Очень важно, чтобы в поле зрения не попали посторонние артефакты — царапины, сколы, жировая пленка.

В работе требуются разные виды предметных стекол:

Эти качества могут сочетаться. Так, например, в каталоге имеются стекла предметные со шлифованными краями и лункой. Возможны и другие комбинации. При наличии специальной матовой полосы облегчается маркировка предметных стекол. Это удобно при создании музея препаратов и для ежедневной маркировки анализов.

Даже у школьников не возникает вопросов, зачем нужно использовать предметное стекло. Это обязательная комплектующая деталь любого микроскопа.

Для сложных исследований крайне важно, чтобы покровное стекло и предметное стекло отвечали всем требованиям международного стандарта качества ISO 9001:2000. Именно такая продукция продается на сайте Апесклаб.

Источник

Покровные стекла для микроскопа – купить или нет?

Став владельцем первого микроскопа в своей жизни, мало кто задумывается о том, что еще нужно для наблюдений и исследований. А ведь в изучении микромира дополнительные аксессуары имеют не меньшее значение, чем функциональные возможности оптического прибора. Предметные и покровные стекла для микроскопа – одни из самых важных аксессуаров, необходимых каждому микробиологу. Их используют для приготовления микропрепаратов, фиксирования образцов на предметном столике и в отдельных случаях даже для фокусировки микроскопа.

Пара слов о предметных стеклах

Предметные стекла для микроскопа – небольшие и тонкие пластинки прямоугольной формы, сделанные из стекла или пластика. На них размещают образцы для исследований. У некоторых видов предметных стекол могут быть небольшие углубления в центре – они служат для удержания капель жидкости. Часто эти аксессуары уже включают в комплект поставки оптического прибора, однако предметные стекла для микроскопа можно купить и отдельно. Обычно они продаются не поштучно, а сразу наборами по 50 или 100 стекол.

Что такое комплект покровных стекол?

Покровное стекло для микроскопа – тоже небольшая и тонкая пластинка, но чаще уже квадратная. Оно располагается поверх исследуемого образца и фиксирует его в одном положении. Схема работы обычно следующая: берется предметное стекло, в его центр помещается исследуемый препарат, далее он закрывается сверху покровным стеклом. При работе с жидкостями покровные стекла также служат для настройки фокуса оптики. Обычно их делают из пластика или стекла и продают наборами по несколько десятков штук. Покровные стекла можно купить в нашем интернет-магазине в этом разделе.

Наборы готовых микропрепаратов

В продаже также можно увидеть готовые микропрепараты в наборах. Они могут быть маленькими (не более 10 штук в комплекте) или же большими, включающими до 100 разных образцов. Готовый микропрепарат – это предметное стекло, на котором уже закреплен специальным образом обработанный срез животной или растительной ткани. Сверху этот образец закрыт покровным стеклом. Преимущество готового препарата в том, что его можно сразу же изучать под микроскопом – не требуется никакой обработки или подготовки образца. Начинающим исследователям микромира мы рекомендуем вначале изучать именно такие образцы и только потом переходить к самостоятельному изготовлению препаратов.

Набор предметных стекол для микроскопа или набор микропрепаратов?

Отдельно хотим обратить ваше внимание, что не стоит путать наборы покровных и предметных стекол с наборами микропрепаратов. Первые – это отдельные прозрачные пластинки, на которых ничего нет, и с которыми вы будете работать с нуля. Вторые – это наборы предметных стекол для микроскопа, на которых уже закреплены препараты. То есть набор микропрепаратов избавит вас от необходимости их самостоятельного изготовления.

В сети магазинов «Четыре глаза» широко представлены аксессуары для микроскопов. У нас вы можете купить готовые микропрепараты и наборы для опытов, комплект покровных стекол, предметные стекла, окуляры и объективы, средства для очистки оптики и многое другое. Наши консультанты всегда готовы помочь с выбором – звоните, пишите и приезжайте в наши магазины!

4glaza.ru
Январь 2018

Статья обновлена в июне 2020 года.

Использование материала полностью для общедоступной публикации на носителях информации и любых форматов запрещено. Разрешено упоминание статьи с активной ссылкой на сайт www.4glaza.ru.

Производитель оставляет за собой право вносить любые изменения в стоимость, модельный ряд и технические характеристики или прекращать производство изделия без предварительного уведомления.

Источник

ПОКРОВНОЕ СТЕКЛО

Смотреть что такое «ПОКРОВНОЕ СТЕКЛО» в других словарях:

покровное стекло — — [Англо русский геммологический словарь. Красноярск, КрасБерри. 2007.] Тематики геммология и ювелирное производство EN sealing glass … Справочник технического переводчика

Покровное стекло — 13. Покровное стекло Конструктивный элемент щитка, предназначенный для защиты светофильтра Источник: ГОСТ 12.4.023 84: Система стандартов безопасности труда. Щитки защитные лицевые. Общие технич … Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации

покровное стекло — laikrodžio stiklas statusas T sritis chemija apibrėžtis Įgaubtas disko pavidalo stiklas indams uždengti, reakcijoms atlikti, medžiagoms sverti ir džiovinti. atitikmenys: angl. clock glass; watch glass rus. покровное стекло; часовое стекло … Chemijos terminų aiškinamasis žodynas

покровное стекло — dengiamasis stiklas statusas T sritis fizika atitikmenys: angl. cover glass vok. Deckglas, n rus. покровное стекло, n pranc. couvre objet, m; lamelle couvre objet, f … Fizikos terminų žodynas

покровное стекло — стеклянная пластинка толщиной 0,1 0,3 мм, которой накрывают исследуемый объект при микроскопии … Большой медицинский словарь

Покровное стекло светового микроскопа — Покровное стекло светового микроскопа – стеклянная пластинка, предназначенная для предохранения микропрепаратов от пыли и механических повреждений. [ГОСТ 28489 90] Рубрика термина: Изделия из стекла Рубрики энциклопедии: Абразивное… … Энциклопедия терминов, определений и пояснений строительных материалов

покровное стекло светового микроскопа — Стеклянная пластинка, предназначенная для предохранения микропрепаратов от пыли и механических повреждений. [ГОСТ 28489 90] Тематики микроскопы Обобщающие термины принадлежности световых микроскопов EN cover glass DE Deckglas FR couvre objet … Справочник технического переводчика

Покровное очковое стекло Покровное стекло Е. Cover plate Cover lenS — 20. Покровное очковое стекло Покровное стекло Е. Cover plate Cover lenS Очковое стекло для зашиты светофильтра от воздействия опасных производственных факторов Источник: ГОСТ 12.4.001 73: Система стандартов безопасности труда. Очки защитные.… … Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации

Покровное стекло светового микроскопа — 37. Покровное стекло светового микроскопа D. Deckglas E. Cover glass F. Couvre objet Стеклянная пластинка, предназначенная для предохранения микропрепаратов от пыли и механических повреждений Источник: ГОСТ 28489 90: Микроскопы световые. Термины… … Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации

покровное очковое стекло — покровное стекло Очковое стекло для защиты светофильтра от разрушения. [ГОСТ 12.4.001 80] Тематики средства индивидуальной защиты Синонимы покровное стекло EN cover plate … Справочник технического переводчика

Источник

Виды стеклопрепаратов

В данной главе расскажем о предметных и покровных стеклах и стандартных микроскопических препаратах.

Предметное и покровное стекла

Для многих видов исследований с помощью биологического микроскоп пригодны различные варианты предметных стекол, имеющиеся в продаже.

В некоторых масляно-иммерсионных темнопольных методиках крайне важной является идеальная толщина; такие стекла продаются.

Покровное стекло: Пластиковые покровные стекла категорически не рекомендуется использовать. Единственная причина, по которой используют пластиковые покровные стекла – это то, что их можно мыть и повторно использовать; в некоторых школах практикуется повторное использование даже предметных стекол. По большей части это утверждение относится к начальным школам, иногда к средним школам — и никогда к университетам.

Порой автор данных слов ощущает себя «гласом вопиющего в пустыне» по поводу использования покровных стекол надлежащего качества. Обычно встречаются покровные стекла классов №1 или №2, в то время как надлежит использовать стекла класса №1.5!

Тот, кто покупает покровные стекла класса №1, полагает, что за свои деньги получает лучшую из имеющихся альтернатив. Тот, кто покупает стекла класса №2, думает, что они не такие хрупкие, и использует их с большей отдачей.

Толщина покровных стекол: класс №1 от 0.13 до 0.17 мм; №1.5 от 0.16 до 0.19 мм; №2 от 0.17 до 0.25 мм.

Почти все производители микроскопов разрабатывают объективы на толщину покровного стекла 0.17 мм. Такие стекла могут попадаться и в классе №1 и в классе №2. Но больше всего покровных стекол оптимальной толщины в классе №1.5. Должны ли мы быть принципиальными в вопросе использования покровных стекол. Думаю, да. Кто-нибудь может случайно попасть в серьезную беду без всякого на это желания!

Существует возможность приобрести масляно-иммерсионные объективы с регулировкой под толщину покровных стекол. Предполагается, что это свойство наиболее важно при больших увеличениях; в то же время замечено, что ценность этой функции снижается вместе со снижением степени увеличения. Данная регулировка встречается в некоторых исследовательских микроскопах.

Применение стандартного препарата

Позвольте внести некоторую объективность в область микроскопии и помочь вам в стандартизации при работе с микроскопом. Гематологические, биохимические и иммуноферментные анализаторы ежедневно тестируются по стандартному образцу. Прибор или показывает правильный ответ, или им не пользуются, пока его не починят. При этом обеспечивается объективность, невозможная при микроскопии.

Есть две причины, по которым рекомендуется использовать стандартный препарат: ежедневная проверка работы микроскопа и оценка микроскопов других марок и моделей.

Выберите интересующий вас препарат с различными характеристиками: хорошим примером служит лёгочная ткань, но можно использовать и многие другие ткани. Они должны быть окрашены гематоксилином и эозином. Ежедневное использование этого препарата для проверки микроскопа позволит вам хорошо запомнить его структуры и особенности в зависимости от положения ирисовой диафрагмы конденсора.

Ежедневная проверка: Используйте 10Х объектив; поднимите конденсор до конца (до соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла ), затем опустите на 0.5 мм. Сфокусируйте препарат, настройте раскрытие полевой и апертурной диафрагм.

Горизонтальное смещение препарата: Во время фокусировки с 10Х объективом следите за горизонтальным перемещением препарата в любом направлении. Изображение должно находиться чётко в фокусе (без расплывчатости и горизонтального смещения).

Эти шаги должны были устранить горизонтальное смещение. Если оно было устранено, то микроскоп готов к ежедневной работе.

Если проблема заключалась в пункте (3), тогда надо отцентрировать конденсор, что возможно. Проблема может быть в оправе, в которой закреплен конденсор. Конденсор в оправе может быть установлен неровно или неплотно. Понаблюдайте за техническим работником, исправляющим неполадки, чтобы в дальнейшем вы сами могли решить проблему, если она снова появится.

Разрешающая способность микроскопа: Убедитесь, что все характерные детали, которые вы обычно наблюдаете на стандартном препарате, присутствуют на нём. Удостоверьтесь, что вы правильно настроили ирисовую диафрагму конденсора. Также проверьте работу 40Х и 100Х объективов.

Если изображение затуманено или загрязнено, то причина может быть в масляной пленке на фронтальной линзе, оставшейся после чистки ксилолом или другими растворителями на основе бензина. Спирты (метанол, этанол, изопропил) чистят так же, как и ксилол, но они менее резкие и не оставляют масляной плёнки. Также могут использоваться и другие растворители. Помните, что растворитель надо наносить на протирочную бумагу, а не на саму линзу, используйте растворитель экономно.

Если вы чётко видите стандартный препарат со всеми характерными чертами, микроскоп готов к ежедневной работе.

Оценка микроскопа: Используйте стандартный препарат для сравнения и оценки других микроскопов. Делайте это на вашем рабочем месте или на выставках, на которых экспонируются микроскопы. Всегда посещайте такие мероприятия и сравнивайте микроскопы.

В тот момент, когда вы будете смотреть в незнакомый микроскоп (перед тем, как вы будете наблюдать свой препарат через него), вы должны учесть две вещи.

Если есть устройство между бинокулярной насадкой и корпусом микроскопа, убедитесь, что оно находится в положении исследования в светлом поле.

Затем осмотрите конденсор на наличие дополнительных линз. Если есть линза под конденсором, то она предназначена для работы с объективами малого увеличения, включая 10Х объектив. Если линза находится над конденсором, то тогда она предназначена для работы с объективами 40Х и 100Х. С того момента, как вы начнёте работу с 10Х объективом, нижняя линза должна находится в оптическом пути или верхняя линза должна быть убрана из оптического пути. Максимально поднимите конденсор, затем опустите его на 0.5 мм. Конденсоры никогда не имеют сразу оба типа указанных выше линз, есть только один тип.

Обратитесь за разрешением на использование стандартного препарата вместо того, что уже установлен в микроскопе. Если вы не видите деталей препарата, которые вы хотели бы увидеть, удостоверьтесь, что микроскоп исправен. Если да, тогда этот микроскоп хуже, чем тот, который у вас уже есть. Не тратьте на него время, но всё же запомните марку и модель на будущее. Наоборот, если вы видите больше, чем было раньше, с лучшим разрешением и контрастом, тогда вы нашли микроскоп лучше того, что был у вас. Уточните, почему этот микроскоп лучше вашего. Спросите про объективы, конденсоры, окуляры и т.д. И что может быть добавлено к нему, например, фазовый контраст, тёмное поле, интерференционный контраст, флуоресценция, и т.д. Даже если вы не собираетесь покупать новый микроскоп, вы можете накопить нужную информацию, чтобы в дальнейшем совершить покупку нужной вам модели.

Микроскопы очень индивидуальны. Рассматривайте незнакомый вам микроскоп с позиции удобства в использовании. Удобно ли вам за ним сидеть? Удобны и просты ли в использовании винты фокусировки и рукоятки перемещения предметного столика? Подходит ли вам угол наклона окуляров? Великоват ли он и требуется ли его уменьшить, чтобы вам стало комфортнее?

Смотрите в более совершенные микроскопы, даже если вам не очень комфортно за ним сидеть. Вы должны научиться всему, чему сможете, и должны уметь оценивать преимущества в оптике, даже если вам это не нравится.

Наконец, это уверит вас в приобретении и использовании стандартного препарата. Если вы также хотите проверить плоскостность поля зрения, примените цитологический препарат и поместите его под покровное стекло для устойчивости препарата.

Картонная коробочка подойдет для хранения одного, двух или более стандартных препаратов.

До сих пор мы концентрировались на светлопольной микроскопии, с этого момента она должна стать для вас простой и понятной. Теперь мы можем подумать о других методах, используемых в микроскопии.

Такие методы, как тёмное поле, флуоресценция, фазовый контраст, дифференциальный интерференционный контраст по Номарскому выполняются с помощью светлопольного микроскопа, но для этого надо установить дополнительные принадлежности и проверить правильность работы микроскопа. Такая проверка осуществляется до перехода к работе другими методами.

В следующий раз сделаем обзор специализированных микроскопов. После чего перейдем теме обслуживания микроскопов и приемам его настройки.

Источник

Изготовление срезов растений и подготовка предметных и покровных стёкол

Анатомические исследования подразумевают, прежде всего, подготовку объектов изучения таким образом, чтобы его можно рассматривать в микроскоп. Наиболее широко распространенным типом микроскопа, особенно на уровне студенческих исследований, является световой, а значит, объект должен пропустить через себя пучок света.

Совершенно изменилась технология работы с изобретением микротома. Эволюция этого аппарата прошла очень быстро по пути совершенствования. Наиболее трудной задачей является механизм закрепления объекта, из которого необходимо изготовить срезы. Если древесина как твердый материал может быть укреплена зажимами, то мелкие объекты (семена), мягкие (лист, кора) не могут быть закреплены таким образом. Есть методы специальной обработки материала (заливка в целлоидин, парафин), но они трудоемки и требуют значительного времени. Чтобы выполнить ВКР с использованием этих методов, надо работать с материалом не менее 3-х лет. Огромным прогрессом стало изобретение замораживающих столиков. Объект к ним прикрепляется с использованием низких температур.

Эти столики могут работать с использованием углекислоты, что более приемлемо для мягких животных тканей, особенно в медицине. В ботанике наиболее удобным являются столики, работающие по типу «холодильника». Постоянный ток проходит через термопару, тепло удаляется проточной водой.

При резке растительных объектов необходимо помнить, что в любом органе присутствуют как мягкие не одревесневшие ткани, так и механические, сильно лигнифицированные. Поэтому очень важно «найти» правильный угол наклона ножа, угол между лезвием ножа и направле­нием его движения.

Толщину среза или устанавливают фиксированную, в этом случае доведение ножа назад до упора обеспечивает поднятие столика на толщину среза, или устанавливают вручную, поднимая после каждого среза замораживающий столик.

Разнообразие растений обуславливает и разнообразие подходов в процессе резки. Очень хорошо режутся лимонник, липа, бузина, очень трудно объекты с твердой древесиной, поэтому каждый новый объект требует некоторого испытания разных приёмов.

Одним плавным, без рывков, движением ножа на себя производят срез, кисточку (желательно беличью) каждый раз смачивают в воде, движением по ножу на себя снимают срез и помещают его в бюксу с водой (ни в коем случае не спиртом, т.к. кисточка, смоченная спиртом, будет переносить его на объект, и приведет к разрушению блока).

Изготовление срезов на микротоме позволяет получить их значительное количество, а значит, позволяет вести отбор для изготовления препаратов. Необходимо готовить срезы разной толщины. Сделать очень тонкий срез, пригодный для фотографирования, но большой площади, невозможно. Срезы большой площади дают возможность судить о соотношении тканей, их топографии.

Если полученные срезы сразу не будут использованы для изготовления препаратов, то в воду следует добавить спирт, и препараты можно сделать на второй день.

Из полученных срезов готовят временные и постоянные препараты, но этому предшествует подготовка предметных и покровных стекол. Основные требования к ним: стекла должны быть обезжирены, что достигается тщательной промывкой. Стекла моют в горячей воде с мылом, протирая с обеих сторон щеточкой. Затем помещают в емкости с наструганным мылом и кипятят в течение часа, осторожно переворачивая их. Не рекомендуется использование специальных порошков, т.к. они оставляют на поверхности налет.

После кипячения стекла тщательно промывают в холодной воде под краном и погружают в насыщенный водный раствор двухромовокислого калия с крепкой серной кислотой в пропорции 3:1 или 4:1 (хромпик). В этой смеси стекла хранят не менее суток, используя по мере необходимости. Перед изготовлением препаратов стекла хорошо промывают от хромпика.

Можно промытые в мыльной воде стекла поместить на несколько часов в 10-15% раствор калийной щелочи, затем промыть водой и перенести в слабый 1-5% раствор соляной кислоты и через 1-2 минуты снова промыть водой.

Предметные стекла, на которые помещают препараты, должны быть хорошо обезжирены и промыты. На правильно подготовленных стёклах нанесенные капли воды хорошо растекаются. Если же на стекле остались следы жира, то вода собирается каплями, не растекаясь. На такие стекла срезы накладывать не следует, так как они не закрепляются на нем.

4.7.1 Изготовление временных препаратов

Для первоначального знакомства с полученными срезами, а иногда и для наблюдения, готовить постоянные препараты нецелесообразно. В этом случае ограничиваются временными препаратами, которые хранят непродолжительное время. Средой, в которую помещают срез, является вода, если материал свежий, т.е. живой. Если материал зафиксирован, то для этой цели используют глицерин (чистый или разбавленный водой) или другие просветляющие жидкости.

Срезы помещают в чистый или слегка разбавленный глицерин, в котором они могут находиться до нескольких месяцев. Для более длительного хранения покровное стекло обводят жидким парафином или канадским бальзамом, чем достигается прикрепление покровного стекла к предметному.

4.7.2 Окраска срезов и приготовление постоянных препаратов

Если срезов несколько, то их окрашивают на предметом стекле. Но при изготовлении срезов на микротоме их готовят несколько десятков, что делает возможным выбор, тогда срезы окрашивают в небольших бюксах. В этом случае срезы помешивают очень осторожно кисточкой, чтобы предотвратить слипание и обеспечить равномерное окрашивание.

Для окрашивания срезов из вегетативных органов растений используют чаще всего сафранин и водный или нильский синий. Вообще, красителей много, их применение обусловлено характером и природой объекта.

Итак, в бюксы, где в воде находятся срезы, добавляют сафранин. В сафранине срезы следует выдерживать не менее 30 минут. Затем, осторожно сливая и добавляя воду, промывают срезы для удаления сафранина. На приготовленное предметное стекло наносят пипеткой несколько капель воды и препаровальными иглами или кисточкой извлекают из стаканчиков (лучше их перелить в чашку Петри) окрашенные сафранином срезы и кладут на предметное стекло. Срезы подбирают по величи­не, как по всей площади объекта, так и более мелкие кусочки, которые, как правило, тоньше. На срезах большей площади устанавливают расположение и соотношение тканей, а тонкие срезы более пригодны для микрофотографирования.

Заранее готовят полоски фильтровальной бумаги по площади в 2 раза превышающие ширину предметного стекла и чуть больше по длине. Берут несколько полосок и, постепенно прижимая их к стеклу по направлению к себе, убирают воду, при этом после полного контакта со стеклом пальцами с нажимом разглаживают бумагу, это обеспечивает хорошее отхождение срезов от фильтровальной бумаги. Подняв бумагу, отбрасывают 2-3 слоя, впитавшие воду, и сразу на срезы пипеткой наносят водный или нильский синий, выдерживают в нем 1-2 минуты (поперечные срезы выдерживают дольше, чем продольные) и таким же приемом фильтровальной бумагой удаляют синюю краску. Далее на срезы поочередно наносят 50%, 75% и 96% спирт, выдерживая в каждом, несколько минут и убирая фильтровальной бумагой. Такое же обезвоживание производят несколько раз, пока не будет заметна резкая разница в окраске разных тканей. Этот прием называют дифференцировкой окраски.

Сафранин окрашивает одревесневшие элементы, а нильский синий нелигнифицированные, тонкостенные. Последним наносят 100% спирт, но если для обезвоживания используют 5-20% карбол-ксилол (смесь фенола с ксилолом), а это чаще всего, то его наносят после 96% спирта, минуя промывку в абсолютном спирте. Эта смесь обладает прекрасным просветляющим и обезвоживающим свойствами, продолжительность выдержки в ней зависит от интенсивности окраски. Убрав бумагой карбол-ксилол, срезы заливают ксилолом. В течение всей дифференцировки (проводки) после каждого погружения осторожно препаровальной иглой корректируют положение срезов на предметном стекле, чтобы они оказались в средней части. Не следует допускать подсыхания срезов, т.к. они свертываются в трубочку.

Трудно рекомендовать время выдержки срезов в каждом из реактивов, т.к. это зависит от толщины среза, характера объекта. Если в процессе дифференцировки срезы плохо обезвожены, они помутнеют при погружении их в ксилол. На прокрашенные и обезвоженные срезы наносят канадский бальзам и закрывают покровным стеклом, опуская его под некоторым углом к предметному стеклу, что способствует удалению воздуха. Количество наносимого бальзама устанавливают в процессе работы, и оно зависит от толщины среза, величины покровного стекла. Важно, чтобы все срезы были закрыты, покровное стекло полностью прилегало к предметному, и бальзам не вытекал в избытке.

После подсыхания в течение нескольких дней препарат маркируют или карандашом по стеклу, или наклеивают этикетку (при изготовлении учебных препаратов фабричным способом). Нельзя препараты держать на сильно освещенных местах, так как они выцветают.

Многие растения (лимонник, липа, пихта, актинидия и др.) содержат многочисленные слизевые идиобласты. Слизь затрудняет работу, т.к. срезы прилипают к фильтровальной бумаге и снять их без повреждения не удается. Избавиться от них можно кипячением в воде, но при этом мягкие ткани коры могут мацерироваться. Лучше заспиртованный материал (срезы) выдержать в 10%-ом водном растворе уксусно-кислого свинца, т.к. слизи теряют способность к набуханию.

4.7.3 Изготовление постоянных препаратов в глицерин-желатине

Этот способ изготовления постоянных препаратов используют в том случае, если хотят оставить неокрашенные препараты (эпидерма листа, мезофилл и т.д.). Окрашенные срезы в глицерин-желатине раскрашиваются. Это быстрый способ изготовления препаратов, причем некоторые структуры на них выявляются резче, чем неокрашенные.

Для приготовления глицерин-желатина берут 1 г желатина, 6 мл дистиллированной воды и 7 мл чистого глицерина. На 100 частей этой смеси добавляют 1 г карболовой кислоты (фенол). Сначала смачивают желатин в указанном количестве воды и оставляют набухать 2 часа, затем приливают глицерин и карболовую кислоту. Смесь при помешива­нии нагревают, пока желатин не растворится до равномерной консистенции. Затем сразу фильтруют через стеклянную вату с помощью воронки с двойными стенками, наполненной горячей водой. Можно пользоваться обычной воронкой, которую необходимо подогревать кругом, не давая ей остыть.

Для получения совершенно прозрачного желатина в теплый раствор глицерин-желатина рекомендуется добавить яичный белок, и нагреть до кипения, размешивая стеклянной палочкой. При этом белок свертывается, адсорбирует все примеси, обуславливающие муть. Глицерин-желатин нагретым надо профильтровать, но после этого мешать смесь ни в коем случае нельзя, т.к. образовавшиеся пузырьки воздуха будут попадать на препараты, а в отличие от канадского бальзама, из которого пузырьки воздуха очень хорошо исчезают, из глицерин-желатина они практически не удаляются. Хранить глицерин-желатин надо в колбе с широким дном, закрывая ее корковой пробкой, в которую через отверстие вставляют стеклянную палочку.

В комнатных условиях глицерин-желатин застывает, поэтому перед работой и в процессе изготовления препаратов его подогревают на водяной бане.

Объекты из мягких тканей в глицерин-желатине сжимаются, поэтому перед нанесением среза на предметное стекло, его сначала помещают в раствор глицерина с водой (1:9). Вода постепенно испаряется, и когда густота глицерина станет достаточной, срез помещают в глицерин-желатин под покровное стекло.

Срезы древесины такой процедуре не подвергают, а прямо из воды помещают под стекло. Избыток глицерина удаляют фильтровальной бумагой. Перед изготовлением предметное стекло слегка нагревают над спиртовкой, кладут срез, помещают на него несколько капель глицерин-желатина и накрывают покровным стеклом, опуская его постепенно на одно ребро наклонно. Тогда покровное стекло, опускаясь, вытесняет воздух. После опускания стекла его не прижимают и не надавливают (в отличие от помещения в канадский бальзам), не сдвигают. Для хранения препарата покровное стекло заключают в рамочку из канадского бальзама, расплавленного воска или парафина, перед этим удаляя выступивший из-под стекла глицерин-желатин.

4.7.4 Анализ препаратов

После изготовления препаратов, особенно при использовании канадского бальзама, им необходимо «подсохнуть». Ксилол, в котором растворяют канадский бальзам, испаряется, и покровное стекло прочно прикрепляется к предметному. Теперь необходимо произвести анализ объектов. Его характер зависит от целей исследования.

Если производится описание структуры нового объекта, о котором данных в литературе нет, то дают подробную его характеристику. Исследуя несколько срезов (они могут быть под одним стеклом), устанавливают общую картину структуры. Определяют гистологический состав объекта, топографию (расположение) тканей на разных срезах, их пара­метры, соотношение, наличие идиобластов и др.

Затем производят подробное описание, отмечая как общие, так и характерные особенности. Ткани описывают не в произвольном порядке, а в порядке их расположения в органе (в стебле – от центра к периферии, или наоборот; в листе от верхней стороны к нижней, или наоборот). Описание сопровождают количественными характеристиками, произво­дя замеры винтовым окуляр-микрометром, а если его нет, то мерной линейкой, вставляемой в окуляр. Предварительно определяют цену деления на всех увеличениях.

При описании тканей отмечают:

— наличие устьиц и тип устьичного аппарата, их количество на единицу площади;

— размеры эпидермальных клеток на поперечных и продольных срезах;

— характер утолщения оболочки (вся ли утолщена или отдельные стен­ки, утолщение равномерное или нет);

— форму клеток на поперечном срезе;

— наличие и тип трихом;

— наличие составных тканей (феллемы, феллодермы, феллогена, так как феллодерма часто может отсутствовать);

— количество клеток феллемы в радиальном ряду в границах годичного слоя;

наличие годичных слоев;

— структуру (гомо- или гетерогенная);

— наличие содержимого в клетках феллемы и других тканей;

— наличие хлоропластов, идиобластов, кристаллов;

— форму очертаний клеток на всех срезах;

— наличие утолщений оболочки и характер утолщения;

В феллодерме обычно отмечают ее ширину, сложение, форму клеток.

— отмечают ее наличие или отсутствие, тип;

— ширину ткани на поперечном срезе;

— наличие в клетках хлоропластов, кристаллов;

— возрастные изменения (склерификация);

— отличие от прилегающих клеток феллодермы и паренхимы первичной коры.

4. В паренхиме первичной коры – (обычно это наиболее развитая ткань молодых стеблей) необходимо отметить:

— форму клеток на поперечном и продольном срезах;

— характер (гомо- или гетерогенная);

— сложение (плотное, рыхлое с хорошо развитой сетью межклетников);

— наличие, форма, размер, локализация кристаллов оксалата кальция;

— наличие млечников, смолоносной системы;

5. В первичной флоэме:

— расположение (сплошным кольцом, участками);

6. Во вторичной флоэме:

— характер расположения аксиальной паренхимы;

— наличие механических элементов и их расположение;

— дифференциацию на проводящую, непроводящую, дилатационную зоны;

— тип и локализацию кристаллов оксалата кальция;

— форму поперечного сечения ситовидных элементов;

— тип ситовидных пластинок и форму ситовидных полей.

7. Во вторичной ксилеме:

— тип (рассеянно-сосудистая, кольцесосудистая или переходного типа);

— рисунок расположения просветов сосудов и их количество на единицу площади;

— форму поперечного сечения сосудов;

— наличие трахеид, волокнистых трахеид, либриформа;

— тип перфорации и межсосудистой поровости и сосудов;

— тип сердцевинных лучей, их структуру, наличие в них идиобластов, оксалата кальция;

— выраженность годичной слоистости.

Методика описания вторичной ксилемы очень подробно дана в книге А.А. Яценко-Хмелевского (1954), которую каждому исследователю необходимо проработать весьма тщательно.

Сравнительный анализ может быть выполнен в следующих двух аспектах:

1. Сравнение структур органов представителей разных таксонов (видов, родов, семейств), при этом больше внимания уделяется качественным признакам, не подверженных влиянию среды, и количественным характеристикам: тип и форма ситовидных пластинок, тип лучей, форма и место локализации оксалата кальция, тип древесины, гистологический состав тканей, выраженность годичной слоистости и т.д.

2. Сравнение представителей одного вида в зависимости от условий произрастания. Сейчас уже установлено, что ни естественные, ни антропогенные факторы практически не влияют на качественные признаки, а значит, большее внимание уделяется количественным. Производят отбор параметров, по которым сравнивают образцы и осуществляют измерения. Обязательно вычисляется достоверность различия между ними. Только в этом случае можно будет говорить о доказанности или недоказанности влияния фактора.

Если производятся наблюдения за формированием органа, т.е. образцы отбираются через равные промежутки времени в течение вегетационного сезона, то прослеживаются изменения как качественных, так и количественных признаков.

Как мы уже отмечали выше, в сравнительных исследованиях очень важна количественная характеристика объекта и его структур. Для производства измерений под микроскопом необходимо иметь объект-микрометр и окуляр-микрометр. Объект-микрометр – это металлическая пластинка, в которую вмонтировано небольшое стекло с нанесенной штриховой линейкой: 1 линейный мм поделен на 100 делений, т.е. каждое деление соответствует 10 мкм.

Винтовой окуляр-микрометр устанавливают вместо окуляра. В нем вмонтирована стеклянная шкала, имеющая 8 делений. Вдоль шкалы при помощи винта, на котором вмонтирован вращающийся барабан с нанесенными по его окружности делениями (100), перемещается подпружиненный движок. На перемещающемся стекле движка нанесены две линии, перекрещивающиеся под прямым углом и две параллельные линии над местом перекреста.

Прежде чем производить измерение, необходимо определить цену деления шкалы барабана. Она определяется для каждого объектива.

Для определения цены деления вместо постоянного препарата на предметный столик помещают объект-микрометр. Винтовой окуляр-микрометр надевают на тубус вместо окуляра. Установив на резкость линейку объект-микрометра, совмещают крайние штрихи линейки на объект-микрометре и в окуляр-микрометре, затем совмещают две параллельные линии с началом линейки (вращая барабан), при этом «0» вращающегося барабана должен совпасть с неподвижным штрихом. Отводя барабаном параллельные линии от нулевого штриха до совпадения с любым штрихом объект-микрометра (но не на полный оборот) подсчитывают число делений по шкале объект-микрометра до параллельных линий и умножают на 10 (одно деление объект-микрометра равно 10 мкм), и, поделив эту цифру на число делений барабана, на которое он переместился от «0», получают цену деления барабана. Цена деления одного большого деления шкалы окуляр-микрометра равна полному обороту – 100 делениям барабана.

Чтобы измерить величину обьекта под микроскопом, после наведения на резкость, совмещают нулевой штрих с началом обьекта, подсчитывают сколько больших делений линейки уместилось на объекте, а оставшуюся часть измеряют вращением барабана.

Допустим, по диаметру клетки поместилось 2 больших деления (100 делений барабана × 2 = 200), после штриха «2» барабан вращают от нуля до совмещения с концом объекта и отсчитывают число делений по барабану, на которое он переместился. Длина объекта в делениях барабана равна 200 плюс число делений барабана (допустим 25). Общая длина 225 делений барабана. Зная цену деления, умножаем на него длину объекта в делениях, получим длину в микронах.

4.7.5 Статистическая обработка результатов

При описании анатомического строения стебля растений необходимо использовать количественные показатели, но нужно иметь в виду, что они варьируют в очень широких пределах, т.к. процесс роста растений испытывает мощное «давление» экологических факторов. Следовательно, обычные размеры элементов даются в разбеге «от» и «до» (например, диаметр сосудов варьирует в пределах 100-150 мкм).

Обязателен математический аппарат в сравнительных исследованиях: анализ влияния экологических факторов, влияние возраста, видовой принадлежности. В том случае должна осуществляться статистическая обработка. В анатомии растений, как и в целом в биологии, вполне приемлем уровень статистической значимости 5% (W=5), соответственно, доверительный уровень равен 95%.

Для получения необходимого показателя производят 25 измерений и обрабатывают неранжированный вариационный ряд. Среднюю арифметическую вариационного ряда ( ) вычисляют по формуле:

, ( )

– сумма всех вариант ряда;

– объём выборки.

После этого определяют величину колебания значений вариант около их средней арифметической, которое характеризуется средним квадратическим отклонением ( ). Вместе со средней арифметической ( ) этот показатель используется для вычисления других показателей. Среднее квадратическое отклонение в квадрате ( ) называется дисперсией.

(1).

Этот показатель характеризует рассеянность вариант около .

Для оценки достоверности средней арифметической вычисляется её ошибка:

, (2),

– ошибка средней арифметической;

– среднее квадратическое отклонение.

Достоверность средней арифметической оценивают по критерию Стьюдента:

(3).

Средняя арифметическая считается достоверной, если вычисленное значение выше табличного. Если же оно меньше табличного, это означает, что или недостаточен объём выборки, для которой найдена средняя величина, или данные не однородны.

В результатах обработки среднюю арифметическую приводят вместе с ошибкой:

Среднее квадратическое отклонение характеризует степень отклонения вариант данной совокупности от средней арифметической в абсолютных числах. Однако, для сравнения совокупностей по их вариабельности необходимо вычислить коэффициент вариации ( ), который показывает, какой процент составляет от средней арифметической:

, % (4).

Если равно:

0-4% – варьирование признака небольшое:

5-44% – варьирование признака нормальное;

45-64% – варьирование признака значительное;

85-104% – варьирование признака очень большое;

более 105% – варьирование признака аномальное.

Важным показателем является точность опыта, который выражает величину ошибки средней арифметической в процентах от самой средней арифметической, т.е. служит показателем точности определения последней:

, или .

Точность опыта считается удовлетворительной, если величина показателя не превышает 5%. При значении более 5%, рекомендуется увеличить число наблюдений или повторностей.

Во многих случаях для получения более полного представления о строении элементов, необходимо проводить мацерацию материала путём разрушения межклеточного вещества, в котором преобладает пектин, что вызывает распад ткани на составляющие её клетки. Можно использовать несколько способов мацерации:

1. Кипячение в воде – используется для мацерации мелких и нежных тканей. Так при кипячении клубней картофеля материал распадается на отдельные клетки.

2. Кипячение материала в течение нескольких минут в едком кали различной концентрации (5-50%) в зависимости от плотности материала. После обработки щёлочью материал промывают водой.

3. Если межклеточное вещество не пропитано или слабо пропитано лигнином, что имеет место у травянистых растений, то применяют способ Мажена. Объект помещают на 24 часа в подкисленную воду или подкисленный спирт (3-5 частей 96% спирта и 1 часть соляной кислоты), после чего объект переносят в 10% раствор аммиака также на 24 часа. После такой выдержки кусочки материала при надавливании пинцетом, кисточкой, иглой легко расчленяются на отдельные клетки. Если расчленение на отдельные структуры происходит с трудом, то используют 30%-ный аммиак. При таком способе мацерации хорошо сохраняется содержимое клетки.

4. Крепкий 30%-ный водный раствор хромового ангидрида. Его используют для мацерации твердого материала (древесина, скорлупа орехов и т.д.). Лезвием опасной бритвы готовят не очень толстые срезы, которые помещают в раствор не более чем на 5 минут, после чего быстро промывают водой. После обработки по этому методу материал легко распадается на элементы.

Необходимо помнить, что объект, подвергаемый мацерации, дол­жен быть однородным. Нельзя мацерировать кусочек, содержащий древесину и флоэму одновременно, т.к. в одном и том же реактиве ткани требуют разной продолжительности воздействия (экспозиции). Пока твердая часть достигает необходимой консистенции, мягкая уже разрушается.

Мацерированный материал можно покрасить эозином, сафранином, гематоксилином. После промывки водой и дегидратации объект можно заключать в канадский бальзам и готовить постоянные препараты.

Источник