Для чего применяется электронная микроскопия

Электронная микроскопия

Электронная микроскопия – один из методов исследования микроструктуры твердых тел, их электрических и магнитных полей, локального состава с применением совокупности электронно-зондовых методов. Данная технология была запатентована в 1931 году Р. Руденбергом, который создал первый в мире электронный микроскоп. Сегодня – это один из наиболее эффективных и передовых методов исследования, который широко используется на предприятиях, в научных, учебных лабораториях.

Метод электронной микроскопии

Данная технология стала основой в создании электронных микроскопов – приборов, в которых для построения изображения используется не световой луч, а поток электронов в вакуумной среде. Роль оптических линз, которые используются в обычных микроскопах, здесь отведена электронному полю. Именно оно и фокусирует электроны. Электромагнитное поле формируется электромагнитными катушками.

Изображение передается на флюоресцирующий экран, где его можно сфотографировать и рассмотреть детально. К изучаемым объектам предъявляется ряд требований:

Разрешающая способность у электронных микроскопов значительно выше, чем у оптических. Величина 0,15 нм (15 А) позволяет получать увеличение в миллионы раз, что идеально подходит для изучения микроскопических объектов.

Основные особенности

Суть метода электронной микроскопии в том, что через исследуемый образец подается электронный пучок разной энергии. Под воздействием электромагнитного поля он фокусируется на поверхности в виде пятна, в диаметре не превышающего 5 нм. Это пятно и выполняет «изучение» объекта. Соприкасаясь с поверхностью, электронный пучок частично проникает в нее, вытесняя не только электроны, но и фотоны. Они попадают на лучевую трубку, где и из них и формируется изображение.

В сравнении со световыми (оптическими) микроскопами, электронные обладают преимуществами:

Виды электронной микроскопии

Выделяют 2 основных вида электронной микроскопии:

Просвечивающая электронная микроскопия

В микроскопах, работающих по этой технологии на объект, воздействует пучок ускоренных электронов, обладающих энергией от 50 до 200 кэВ. Те электроны, которые образец не пропустит, будут отклоняться на небольшой угол. И они, и те, которые пройдут через исследуемый объект с незначительными энергетическими потерями, попадают на магнитные линзы. В результате на фотопленке или люминесцентном экране формируется изображение внутренней структуры. Хорошие результаты дает при исследовании ультратонких образцов – менее 0,1 мкм в толщину.

При работе с ПЭМ одна из наиболее важных задач – различать природу контрастов:

Одна из разновидностей ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения (ВРЭМ). Формируется в случае, когда пучок электронов падает параллельно оси кристаллов в условиях фазового контраста. Позволяет диагностировать даже мельчайшие неоднородности кристаллической решетки.

Сканирующая электронная микроскопия

Сканирующей электронной микроскопией (СЭМ) получают изображения поверхности исследуемого образца с высокой разрешающей способностью. Получают трехмерные картинки, которые будут удобными в процессе изучения структуры. Дополнительно можно использовать методики EDX, WDX, чтобы получить информацию о химическом составе околоповерхностных слоев.

В оборудовании сфокусированный электронный пучок средней энергии сканирует образец. Предусмотрено несколько режимов работы:

Эти методики позволяют не только изучать свойства поверхности, но и получать наглядную информацию о структурах, расположенных на несколько микрон ниже верхнего слоя.

СЭМ может работать только с образами, которые можно погружать в вакуум – твердыми. Жидкие среды предварительно подвергают криозаморозке. Форма и размеры образца ограничиваются только размерами рабочей камеры микроскопа. Эффективность исследования можно повысить путем напыления слоя токопроводящего материала.

Возможности

Технология электронной микроскопии постоянно развивается:

Благодаря последним наработкам метод электронной микроскопии используют уже и при работах с влажными образцами, исключая нарушение их структуры и локального состава. Для этого применяется низкотемпературное замещение воды, сверхбыстрое замораживание в среде хладагента, прижим к металлу, который охлаждается жидким азотом и пр. Существенно возможности метода расширило использование компьютерной техники, в частности математическая обработка электронных изображений. Теперь изображения можно запоминать, корректировать контрастность, добавлять оттенки цветов, выделять микроструктуры, убирать шумы, выделять границы исследуемых участков и пр.

Области применения

Метод электронной микроскопии используют для изучения поверхности объектов, ультратонких срезов тканей, микробов. С его помощью определяют строение жгутиков, вирусов и пр. Оборудование, основанное на этой технологии, широко используется в различных научных и производственных отраслях:

Главная задача – подобрать микроскоп, работающий электронным методом под особенности предстоящих работ. В каталоге компании «Sernia Инжиниринг» можно подобрать подходящее оборудование для любой научно-исследовательской и производственной задачи. Приборы поставляются по Москве, Санкт-Петербургу и в другие регионы РФ. Все они имеют сертификаты соответствия, на них действуют гарантии. Узнать актуальные цены, условия сотрудничества, получить консультации и помощь в выборе можно у менеджеров компании. Свяжитесь с ними по телефону или через онлайн-форму.

А.С.Илюшин, А.П.Орешко. Введение в дифракционный структурный анализ. М.: физический факультет МГУ, 2008

Источник

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

Электронная микроскопия — метод морфологического исследования объектов с помощью потока электронов, позволяющий изучать структуру этих объектов на макромолекулярном и субклеточном уровнях.

После выпуска первой промышленной модели просвечивающего (трансмиссионного) электронного микроскопа (см.) электронная микроскопия прошла большой путь развития и позволила перейти на качественно новый уровень изучения материи. Электронная микроскопия нашла широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, биохимии, онкологии, медицинской генетике, иммунологии. Благодаря электронной микроскопии раскрыта субмикроскопическая структура клеток, открыт ряд неизвестных ранее клеточных органелл, таких как лизосомы (см.), рибосомы (см.), эндоплазматический ретикулум, микротрубочки, цитоскелет, структуры, специфичные для отдельных видов клеток (см. Клетка). Электронная микроскопия позволила понять многие тонкие механизмы развития болезней, в том числе на ранних этапах их возникновения, еще до появления четкой клинической симптоматики.

Электронная микроскопия все шире применяется для ранней диагностики заболеваний, а также для выявления этиологии инфекционных процессов. Ее используют в онкологии для определения гистогенеза опухолей (см.), что имеет важное значение в лечении и прогнозе онкологического заболевания. В нефрологии исследование с помощью электронной микроскопии материала, полученного при пункционной биоп сии, позволяет выявить ранние морфологические изменения структур почек, диагностировать форму гломерулонефрита (см.) и т. п. При электронной микроскопии пунктатов печени удается провести дифференциальную диагностику гематитов (см. Гепатит), гепатозов (см.) и других заболеваний печени, определить активность процесса и нередко его этиологию.

Исследования строения материи на субклеточном и макромолекулярном уровнях сдерживаются возможностями разрешающей способности электронных микроскопов (см. Электронный микроскоп). Использование электронной микроскопии в сочетании с другими методами, например с авторадиографией, гистохимическими, иммунологическими методами, обусловило появление электронной авторадиографии, (см.), электронной гистохимии (см.), иммунной электронной микроскопии (электронной иммуноморфологии) и др. Это позволило значительно расширить информацию, получаемую с помощью электронной микроскопии, наблюдать структурное выражение течения биохимических процессов в клетке, что, в свою очередь, подтвердило один из основных методологических принципов современной биологии — диалектическое единство структуры и функции.

Электронная микроскопия требует специальной подготовки объектов изучения, от которой в значительной мере зависят возможности метода. В соответствии с целями исследования методика такой подготовки может быть различной. Однако непременным условием при любых электронно-микроскопических исследованиях является фиксация тканей или микробов с максимальным сохранением их прижизненного строения. Существует два принципиально различных способа фиксации — химический и физический; каждый из них имеет различные варианты.

В электронной микроскопии, как правило, используют химическую фиксацию с помощью фиксаторов, обладающих стабилизирующими свойствами. Универсального для любых тканей фиксатора не существует, поэтому в зависимости от задач конкретного исследования применяют соответствующие фиксаторы. При выборе хим. фиксаторов исходят из их способности коагулировать белки (спирты, ацетон, некоторые кислоты, соли тяжелых металлов и др.) либо стабилизировать липиды и гели (четырехокись осмия, глутаровый альдегид, формалин, двухромовокислый калий и др.).

Для избирательной фиксации отдельных субклеточных структур используют более специфические фиксаторы (перманганат калия, двухромовокислый калий и др.). Качество фиксации в значительной степени зависит от pH и осмотического давления фиксирующего раствора. Оптимальным является pH 7,2—7,4, что соответствует физиологическим параметрам. Поэтому применяют буферные растворы (см.). Чаще применяют фосфатные или какодилатный буферы. Физиологическое осмотическое давление создают путем добавления осмотически активных веществ, например сахарозы или некоторых солей.

Имеется несколько методов химической фиксации: перфузионный, когда фиксатор вводят в ток крови; фиксация на месте, когда фиксатор вводят в ткань до ее иссечения: метод погружения иссеченных кусочков ткани в фиксатор. Для замедления аутолитических процессов, протекающих в иссеченных кусочках ткани до полной их фиксации, последнюю проводят при 2—5°.

После фиксации необходимо осуществить обезвоживание ткани. Этот процесс должен быть относительно быстрым, постепенным и вместе с тем обеспечить максимально полное удаление воды из образца, что достигается проведением подлежащей исследованию ткани через батарею спиртов или ацетонов восходящей концентрации (от 30 до 100%) в течение 1 часа.

Следующим важным этапом подготовки материала для электронной микроскопии является заливка (заключение) тканей в заливочные среды с целью получения блока, обладающего оптимальным сочетанием твердости и эластичности, позволяющим приготовить тонкий срез ткани (толщиной менее 100 нм), через который может пройти электронный луч. Первым заливочным материалом были метелметакрилат и бутилметакрилат. В настоящее время они почти не применяются, так как токсичны и легко возгоняются под пучком электронов, что приводит к выраженным артефактам и загрязнению электронного микроскопа. Наиболее широко для заливки тканей используют эпоксидные смолы, в основном аралдит и эпон, часто применяемые совместно. Менее распространены полиэфирные смолы (вестопал W) и водорастворимые заливочные смеси, из которых чаще пользуются гликольметакрилатом и дуркупаном. Однако ни одна заливочная среда не является химически инертной и в какой-то степени оказывает влияние на ткань; это необходимо учитывать при интерпретации результатов микроскопировання.

В последние годы широкое применение нашла заливка в так наз. компаунды, то есть в смесь определенных веществ: основы (мономера), отвердителя, придающего образующемуся полимеру прочность и твердость, пластификатора, обеспечивающего эластичность и упругость полимера, инициатора, диссоциирующего с образованием свободных радикалов, ускорителя, который, взаимодействуя с мономером, освобождает дополнительные активные радикалы, и катализатора, способствующего началу реакции полимеризации. В практике обычно используют компаунд, состоящий из основы, отвердителя, пластификатора и катализатора, роль которого может играть ускоритель или инициатор. Имеется достаточно большое количество способов пропитки ткани заливочными средами. Процесс пропитки обычно протекает при комнатной температуре или в термостате при t° 30—48° в течение 15—48 часов. Затем кусочки ткани переносят в маркированные желатиновые капсулы или специальные формы, наполненные заливочной смесью. Для полимеризации смеси капсулы на 48 часов помещают в термостат при t° 60° либо оставляют в течение 24 часов при комнатной температуре, затем на 24 часа их помещают в термостат при t° 48° и еще на 24 часа — при t° 60°. В результате полимеризации образуется блок, обладающий соответствующими свойствами.

Для получения ультратонких срезов толщиной 30—50 нм используются стеклянные или алмазные ножи. Алмазные ножи долговечнее стеклянных, но из-за высокой стоимости они не получили широкого распространения.

Для контрастирования срезов применяют вещества с большим атомным весом, такие как соли тяжелых металлов, интенсивно рассеивающие электроны. Ионы некоторых из этих веществ могут образовывать связи с кислородом и присоединяться к фосфатным группам нуклеиновых кислот; другие, особенно уранилацетат, помимо этого, действуют как универсальные красители на белки; свинец связывается с комплексами ткани и осмиевыми фиксаторами. Повышают контрастность и сами фиксаторы. Обычно проводят контрастирование ультратонких срезов или сочетают контрастирование кусочков и ультратонких срезов ткани, после чего их изучают в электронном микроскопе.

Химические методы фиксации и заливка материала имеют ряд недостатков. Так, при их использовании происходят химические изменения макромолекулярной структуры клеток; при фиксации и обезвоживании клетки и ткани теряют некоторые вещества; при взаимодействии ткани, фиксатора и заливочной среды может меняться локализация внутриклеточных структур. Поэтому интенсивно разрабатываются физические методы приготовления ткани для электронной микроскопии и особенно для электронной гистохимии (см.) и цитохимии (см.). Большая часть этих методов основана на очень быстром замораживании кусочков ткани.

Метод криоскалывания (замораживания—травления) позволяет избежать возникновения химических реакций при обработке ткани. Фрагменты тканей замораживают в хладоагенте со скоростью, превышающей 1000° в 1 сек. Объект помещают в вакуумную камеру и тем или иным способом раскалывают или разрывают. На поверхность скола наносят платиноуглеродное покрытие (реплику). Затем реплику очищают от органических остатков в растворе сильного окислителя, промывают в воде и помещают на сеточку для электронной микроскопии.

Для исследования поверхности биол. тканей используют методы реплик и оттенения. Наибольшее распространение получил метод приготовления реплик путем напыления в вакуумной камере углерода на поверхность образца ткани. Для контрастирования образовавшейся реплики на нее под острым углом напыляют электронно-плотные вещества (например, платину или платино-иридиевый сплав). При этом количество атомов металла значительно больше на той стороне контуров образца, которая ближе к источнику напыления; при исследовании в электронном микроскопе она выглядит неконтрастной. Противоположная поверхность контуров имеет мало атомов металла; в электронном микроскопе она контрастна и как бы оттеняет неконтрастную поверхность контура. Метод оттенения позволяет рассчитать высоту контуров исследуемого объекта, так как известны угод напыления, длина тени и увеличение, при котором производилось фотографирование реплики в электронном микроскопе.

Для изучения поверхности изолированных клеток и тканей служит сканирующая (растровая) электронная микроскопия. Одним из основных условий приготовления объекта для сканирующей электронной микроскопии является необходимость сохранения соответствующего поверхностного натяжения клеток во избежание их деформации. Поверхность изучаемой ткани промывают сбалансированными изотоническими забуференными солевыми растворами или безбелковыми культуральными средами с pH 7,3—7,4, подогретыми до t° 37°. Для фиксации обычно применяют изотонический раствор глутарового альдегида с последующей дофиксацией четырехокисью осмия. Ткань обезвоживают в спиртах или ацетонах, а затем высушивают методами замораживания—высушивания или перехода критической точки. Последний основан на использовании такого физического явления, как возникновение при определенных условиях критического состояния равновесия пара и жидкости. При этом методе ткань оказывается в газовой среде (то есть высушенной), что позволяет избежать повреждающего действия поверхностного натяжения. Для достижения высоких степеней разрешения. повышают электропроводность объекта, напыляя на него тяжелые металлы — золото, платину, серебро или их сплавы. Применяется также метод ионной бомбардировки в вакууме пластинки металла ионами инертного газа. «Выбитые» атомы металла оседают на поверхности объекта исследования. Для выявления внутритканевых и внутриклеточных структур применяют механические, термические, химические и другие методы.

Для электронной микроскопии микробов применяют сходные методы с учетом особенностей строения микробов, их размеров, осмотического давления и др. Так, особый подход осуществляется при электронной микроскопии вирусов. Изучение структуры вирусов затруднено из-за малых размеров и слабой рассеивающей способности вириона. На первых этапах электронной микроскопии вирусов эта трудность преодолевалась оттенением частиц при испарении тяжелых металлов в вакууме. Вплоть до конца 50-х годов 20 века методика оттенения вирусных частиц была основной при изучении вирусов в суспензиях. Чаще для этой методики использовали уран-238, платину, палладий или сплавы платины с палладием. Наибольшее распространение получил сплав платины с палладием в отношении 4:1. Зная заданный угол оттенения по длине образующейся тени, определяют высоту вирусной частицы и ее диаметр. Оттенение металлами исследуемого объекта при сочетании с криогенными методиками (замораживание—высушивание) позволяет получить важную информацию при изучении структуры вириона изометрических вирусов.

Широкое распространение получила методика негативного контрастирования вирусов с помощью вольфрамофосфорной кислоты (HзPW12O40), которая при подщелачивают едким калием или едким натрием (от значения pH Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание

Источник

5 разных типов микроскопов и их применение

Как и многие другие технологические устройства, микроскопы имеют очень долгую историю. Самые ранние микроскопы содержали простое увеличительное стекло с малой мощностью (до 10 раз). Их использовали для наблюдения за маленькими насекомыми, такими как блохи.

Ранние версии оптических микроскопов были разработаны в конце 15 века. Хотя изобретатель неизвестен, за эти годы было сделано несколько заявлений. Использование микроскопов для исследования органических тканей появилось только в 1644 году.

Сегодня у нас есть микроскопы, которые могут обеспечить разрешение в 50 пикометров с увеличением до 50 миллионов раз, что достаточно для наблюдения ультраструктуры различных неорганических и биологических образцов.

1. Оптические микроскопы

Оптические микроскопы являются наиболее распространенными микроскопами, которые используют свет, чтобы пройти через образец для генерации изображений. Они могут иметь очень простую конструкцию, хотя сложные оптические микроскопы направлены на повышение разрешения и контрастности образца.

В дальнейшем их можно подразделить на два типа: простые и сложные микроскопы. Простой микроскоп использует одну линзу (например, увеличительное стекло) для увеличения, в то время как сложные микроскопы используют несколько линз для увеличения образца.

Они часто оснащены цифровой камерой, поэтому образец можно наблюдать с помощью компьютера. Это позволяет провести глубокий анализ микроскопического изображения.

Оптические микроскопы могут обеспечивать увеличение до 1250 раз с теоретическим пределом разрешения 0,250 микрометров. Тем не менее развитие сверхразрешенной флуоресцентной микроскопии в последнее десятилетие привело оптическую микроскопию в наноразмерность.

Варианты оптического микроскопа

Применение

Основные оптические микроскопы часто встречаются в классах и дома. Сложные широко используются в фармацевтических исследованиях, микробиологии, микроэлектронике, нанофизике и минералогии.

Они часто используются для исследования тканей с целью изучения проявлений заболеваний. В клинической медицине исследование биопсии или хирургического образца относится к гистопатологии.

2. Электронные микроскопы

Электронный микроскоп использует пучок ускоренных электронов для получения изображения образца. Точно так же, как оптические микроскопы используют стеклянные линзы, электронные микроскопы используют фасонные магнитные поля для создания систем электронно-оптических линз.

Поскольку длина волны электрона может быть намного короче, чем у фотонов, электронные микроскопы имеют более высокую разрешающую способность и увеличение, чем обычные оптические микроскопы. Они могут выявить структуры объектов размером с пикометр.

Первый электронный микроскоп, который превысил разрешение, достигнутое с помощью оптического микроскопа, был разработан немецким физиком Эрнстом Руской в ​​1933 году. С тех пор были сделаны многочисленные улучшения для дальнейшего улучшения увеличения и разрешения микроскопа.

Современные электронные микроскопы способны увеличивать образцы до 2000000 раз, однако они все еще полагаются на прототип Руска (разработанный в 1931 году) и его связь между разрешением и длиной волны.

Электронные микроскопы имеют некоторые ограничения: они дороги в изготовлении, обслуживании и должны быть размещены в стабильных средах, таких как системы подавления магнитного поля. Также объекты должны просматриваться в вакууме.

Современный просвечивающий электронный микроскоп | Предоставлено: Дэвид Морган из Кембриджа, Великобритания.

Два основных типа электронного микроскопа

1. Просвечивающий электронный микроскоп: используется для наблюдения за тонкими образцами, через которые могут проходить электроны, создавая проекционное изображение. Он может захватывать мелкие детали размером с колонку атомов.

В этом случае образец обычно представляет собой очень тонкий срез (

Современный сканирующий зондовый микроскоп

Распространенные типы сканирующих зондовых микроскопов

А) Атомно-силовой микроскоп: имеет разрешение порядка долей нанометра, что позволяет получать изображения практически любого типа поверхности, включая стекло, полимеры и биологические образцы.

B) Сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля: может достигать производительности пространственного разрешения сверх классического дифракционного предела. Он может быть использован для изучения всех проводящих, непроводящих и прозрачных образцов.

C) Сканирующие туннельные микроскопы: могут достигать бокового разрешения 0,1 нм и глубины 0,01 нм. Образцы могут быть отображены в экстремальных условиях, при температурах от почти абсолютного нуля до более 1000 ° C.

Применение

Сканирующие зондовые микроскопы используются в широком спектре естественных наук, включая медицину, клеточную и молекулярную биологию, физику твердого тела, химию полимеров и полупроводниковую науку и технику.

Например, в молекулярной биологии этот метод микроскопии используется для анализа структуры и механических характеристик белковых комплексов и сборок. В клеточной биологии он используется для определения взаимодействия между определенными клетками и различения нормальных клеток и раковых клеток на основе твердости клеток.

В физике твердого тела он используется для изучения взаимодействия между соседними атомами и изменений в расположении атомов посредством атомных манипуляций.

4. Сканирующие акустические микроскопы

Сканирующий акустический микроскоп измеряет изменения акустического импеданса с помощью звуковых волн. Он в основном используется для неразрушающей оценки, анализа отказов и выявления дефектов в недрах материалов, в том числе обнаруженных в интегральных микросхемах.

Этот тип микроскопа был впервые разработан в 1974 году в микроволновой лаборатории Стэнфордского университета. С тех пор были сделаны многочисленные улучшения для повышения его точности и разрешения.

Микроскоп непосредственно фокусирует звук от датчика в маленькой точке на образце. Звук, падающий на объекты, либо поглощается, либо рассеивается под разными углами. Эти рассеянные импульсы, распространяющиеся в определенном направлении, дают полезную информацию об образце.

Разрешение образца изображения либо ограничено шириной звукового луча (зависит от частоты звука), либо физическим разрешением сканирования.

В отличие от обычных оптических микроскопов, которые позволяют наблюдать поверхность образца, акустические микроскопы фокусируются на определенной точке и получают изображения из более глубоких слоев. Кроме того, они обеспечивают более точные результаты и увеличивают объём данных, сохраняя при этом целостность образца.

Сканирующий акустический микроскоп Sonix HS 1000

Применение

Многие компании используют этот тип микроскопии в аналитических лабораториях для определения качества своих электронных компонентов. Производители также используют его для контроля качества, квалификации поставщиков, тестирования надежности продукции, а также для исследований и разработок.

В биологии эти микроскопы предоставляют полезные данные о физических силах, удерживающих структуры в определенных формах, таких как эластичность клеток и тканей. Это чрезвычайно полезно при изучении процесса подвижности клеток (способность организма самостоятельно передвигаться, используя метаболическую энергию).

5. Рентгеновский микроскоп

Рентгеновские микроскопы генерируют увеличенные изображения объектов, используя электромагнитное излучение в мягком луче. Они способны выдавать 3D-изображение компьютерной томографии относительно больших образцов с высоким разрешением.

Для идентификации рентгеновских лучей, проходящих через образец, используется детектор с зарядовой связью. Поскольку рентгеновские лучи легко проникают сквозь вещество, микроскопы этого типа могут отображать внутреннюю часть образцов, непрозрачных для видимого света.

Современные рентгеновские микроскопы позволяют наблюдать различные образцы, в том числе те, которые имеют низкий контраст поглощения и более плотный материал, например керамические композиты. Чтобы достичь этого, микроскоп изменяет длину волны рентгеновского излучения, что увеличивает контраст или проникновение.

Его разрешение лежит между оптической микроскопией и электронной микроскопией. В отличие от традиционных электронных микроскопов, рентгеновские микроскопы могут отображать толстые биологические материалы в их естественном состоянии.

Рентгеновский микроскоп ZEISS Xradia 510 Versa

Применение

Рентгеновская микроскопия оказалась чрезвычайно полезной в области медицины и материаловедения. Он был использован для анализа структуры различных тканей и образцов биопсии.

В области материаловедения рентгеновские микроскопы могут определять структуру кристалла вплоть до размещения отдельных атомов внутри его молекул. Он также обеспечивает неразрушающий, неинвазивный метод поиска дефектов в трех измерениях.

Источник