Докажите что возможности дифференциальных способов окраски больше чем рутинных
Дифференциальная окраска хромосом.
В зависимости от целей цитогенетического исследования используются различные методы окрашивания хромосом (см. рис. 9). Наиболее распространенными из них являются рутинная или обычная окраска и ряд методов дифференциального окрашивания хромосом: Q-, G, С-, R- и NOR- или Ag-окраска.В свою очередь, методы
дифференциального окрашивания делятся на две группы:
1) приводящие к образованию сегментов вдоль длины всех хромосом (например Q-, G- или R-сегменты);
2) приводящие к окрашиванию специфических хромосомных структур, в результате чего выявляется ограниченное число сегментов (С-, Т- или NOR-сегменты). Рис.9.Методы окрашивания хромосом (8)
Рутинная окраскахромосом достигается путем простого окрашивания полученных хромосомных препаратов красителем Романовского-Гимза (азурэозином) или 2% ацетоорсеином, или 2% ацетокармином, без какой-либо их предварительной обработки. Такая окраска приводит к равномерному и интенсивному прокрашиванию хромосом по длине, что не позволяет идентифицировать разные морфологически сходные хромосомы набора. Исторически рутинная окраска была самой первой используемой в цитогенетике человека окраской, активно применяющейся в течение 1959-1970 гг., до внедрения методов дифференциального окрашивания хромосом. В настоящее время она практически не применяется для диагностики конституциональных хромосомных нарушений, однако находит применение при анализе хромосомных аберраций в тестировании факторов среды на мутагенную активность. Такую окраску можно применять для выявления численных аномалий хромосом.
Рутинный и дифференциальный методы окрашивания метафазных хромосом для последующего кариотипирования. их решающая способность.
Дифференциальные методы- С-метод: краситель-гимза, орсеин, кармин; уч.хром-гетерохроматин; основ.прим-выявление структурного гетерохроматина.
G-метод: крас-гимза. Уч.хром-G-сегменты. Основ.прим-индивидуализация метафазных хромосом и их фрагментов.
Ag-метод: крас.-нитрат серебра. Уч.хром-ядрышкообраующие районы. Основ.прим-выявление полиморфизма хромосом по ядрышкообразующим районам.
Q-метод: крас.-акрихин,акрихин-иприт,пропил-акрихин; уч.хром-гетерохроматиновые районы. Основ.прим.-индивидуализация метафазных хромосом,определение ху полового хроматина.
FISH-метод: крас-флуорохромосомы; уч.хром-каждая хромосома окрашивается своим собственным цветом. Основ.прим-индивидуализация каждой хромосомы,явление хромосомных перестроек.
Понятие о жцк
Жизненный цикл — это время существования клетки от момента ее образования путем деления материнской клетки до собственного деления или естественной гибели.
У клеток сложного организма жизненный цикл клетки может быть различным. Высокоспециализированные клетки (эритроциты, нервные клетки, клетки поперечнополосатой мускулатуры) не размножаются. Их жизненный цикл состоит из рождения, выполнения предназначенных функций, гибели (гетерокаталитической интерфазы).Важнейшим компонентом клеточного цикла является митотический цикл. Он представляет собой комплекс взаимосвязанных и согласованных явлений во время деления клетки, а также до и после него. Митотический цикл — это совокупность процессов, происходящих в клетке от одного деления до следующего и заканчивающихся образованием двух клеток следующей генерации. Кроме этого, в понятие жизненного цикла входят также период выполнения клеткой своих функций и периоды покоя. В это время дальнейшая клеточная судьба неопределенна: клетка может начать делиться либо начать готовиться к выполнению специфических функций.
Митоз — это основной тип деления соматических эукариотических клеток. Процесс деления включает в себя несколько последовательных фаз и представляет собой цикл. Его продолжительность различна и составляет у большинства клеток от 10 до 50 ч. При этом у клеток тела человека продолжительность самого митоза составляет 1—1,5 ч, G2-периода интерфазы — 2—3 ч, S-периода интерфазы — 6—10 ч.
Основные периоды жцк,способных к делению. Их характеристика. пример.
Клеточный цикл состоит из двух периодов:
Период клеточного роста, называемый «интерфаза», во время которого идет синтез ДНК и белков и осуществляется подготовка к делению клетки.
Периода клеточного деления, называемый «фаза М».
Интерфаза состоит из нескольких периодов:
G1-фазы, или фазы начального роста, во время которой идет синтез мРНК, белков, других клеточных компонентов;
S-фазы, во время которой идет репликация ДНК клеточного ядра, также происходит удвоение центриолей.
G2-фазы, во время которой идет подготовка к митозу.
Например: Зигота, образовавшаяся после слияния яйцеклетки и сперматозоида, делится с образованием двух дочерних клеток. Затем, в результате последовательных делений, образуются четыре, восемь, шестнадцать клеток и так далее. Параллельно с увеличением численности на этапе эмбриогенеза происходит дифференцировка клеток – так образуются ткани
Научная электронная библиотека
Соколова Т А, Котловский Ю В, Дубынина Е В, Ивановская О В, Веселова В К, Кузнецова Е Ю,
1.2. Окрашивание хромосом
В зависимости от целей цитогенетического исследования используются различные методы окрашивания хромосом. Наиболее распространенными из них являются рутинная или обычная окраска и ряд методов дифференциального окрашивания хромосом: Q-, G-, C-, R- и NOR- или Ag-окраска. В свою очередь методы дифференциального окрашивания делятся на две группы:
1) приводящие к образованию сегментов вдоль длины всех хромосом (например Q-, G- или R-сегменты);
2) приводящие к окрашиванию специфических хромосомных структур, в результате чего выявляется ограниченное число сегментов (С-, Т- или NOR-сегменты).
Для обозначения вида окраски используется система трехбуквенного обозначения, включающая основной метод окраски, вариант предварительной обработки препарата хромосом и название красителя (GTG, RHG, QFQ и т.д.). Структуры, выявляющиеся по длине хромосом в соответствии с типом окраски называют Q-, G-, C-, R-сегментами (bands).
Рутинная окраска хромосом достигается путем простого окрашивания полученных хромосомных препаратов красителем Романовского-Гимза (азур-эозином), без какой либо предварительной обработки. Такая окраска приводит к сплошному прокрашиванию хромосом по длине, что не позволяет идентифицировать разные морфологически сходные хромосомы. Рутинная окраска была самой первой используемой в цитогенетике человека окраской, активно применяющейся в течение 1959–1970 гг., до внедрения методов дифференциального окрашивания хромосом. В настоящее время она практически не применяется для диагностики конституциональных хромосомных нарушений, однако находит применение при анализе хромосомных аберраций в тестировании факторов среды на мутагенную активность.
Q-окраска (от англ. Quinacrine – акрихин) выявляется на хромосомах в виде чередования ярко- и темнофлюоресцирующих полос с помощью флуоресцентной микроскопии хромосомных препаратов, окрашенных такими флюорохромами (флуоресцентными красителями) как производные акридина – акрихин дигидрохлорид (атебрин) или акрихин-иприт. Эти красители обладают способностью присоединяться к ДНК путем интеркаляции или с помощью внешних ионных сил. Q-окраска имеет свою кодировку (QFQ) по международной цитогенетической номенклатуре. Заслуга применения производных акрихина для получения Q-сегментов на хромосомах человека принадлежит шведскому цитогенетику Касперсону (1970). В популяциях человека существует межиндивидуальная вариабельность отдельных участков хромосом, выявляемых с помощью Q-окраски – Q-полиморфизм хромосом. Он выражается в особенно ярко светящихся сегментах, локализованных в центромерных участках хромосом 3 и 4, а также в коротких плечах и спутниках всех акроцентрических хромосом человека 13–15, 21 и 22. кроме того, у лиц мужского пола ярко флюоресцирующейся областью является и дистальная часть длинного плеча хромосомы Y – сегмент q12. Этот участок Y-хромосомы обладает выраженным межиндивидуальным полиморфизмом и четко наследуется по мужской линии. Все перечисленные ярко флюоресцирующие участки хромосом являются областями локализации гетерохроматина – некодирующихся повторяющихся последовательностей ДНК, вариабельность которых не приводит к каким-либо фенотипическим изменениям. Указанные выше ярко флюоресцирующие Q-полиморфные хромосомные сегменты являются удобными цитогенетическими маркерами и могут быть использованы как для характеристики популяций, индивидов и клеточных линий, так и для решения некоторых судебно-медицинских проблем.
G-окраска (от англ. Giemsa – Гимза) выявляется благодаря предварительной обработке хромосомных препаратов слабым раствором протеолитического фермента трипсина и последующей окраске красителем Гимза. При этом наблюдается полосатая исчерченность хромосом, где темные полосы в некоторой степени соответствуют гетерохроматиновым районам, а светлые – эухроматиновым. G-окраска имеет свою кодировку (GTG) по международной цитогенетической номенклатуре. Оптимальные условия окраски находят в каждой лаборатории эмпирическим путем. Методика G-окраски хромосом человека была впервые предложена английской исследовательницей Мариной Сибрайт (Seabright) в 1972 году и практически в неизменном виде используется до настоящего времени. По числу, величине и расположению выявляющихся сегментов рисунок G-окраски аналогичен рисунку при Q-окраске, где темно окрашенные G-сегменты соответствуют флюоресцирующим Q-сегментам. Различия состоят в том, что:
а) несветящиеся гетерохроматиновые центромерные сегменты в хромосомах 1 и 16 хорошо прокрашиваются красителем Гимза;
б) ярко флюоресцирующие при Q-окраске сегменты 3, 4, 13 – 15, 21, 22 и Y-хромосом не выделяются особой интенсивностью при G-окраске. На G-окрашенных метафазных хромосомах выделяется около 320 сегментов на гаплоидный геном.
R-окраска (от англ. Reverse – обратная) отличается противоположностью рисунка G-окраске. Темноокрашенными здесь являются эухроматиновые участки хромосом, а светлыми – гетерохроматиновые. Существует несколько модификаций метода R-окраски и каждый из них имеет кодировку по международной цитогенетической номенклатуре. Наиболее приемлемой является обработка препаратов Ba(OH)2 с прогреванием их при 60 °С и последующей отмывкой в дистиллированной воде и окрашиванием раствором красителя Гимза. Кодировка R-окраски, полученной таким способом – RHG.
С-окраска (от англ. Constitutive heterohromatin – конститутивный гетерохроматин) выявляется в виде вариабельных по величине темноокрашенных сегментов конститутивного гетерохроматина в прицентромерных районах хромосом, в то время как эухроматиновые участки хромосом прокрашиваются очень бледно. Методы получения С-окраски могут варьировать, но важным условием является предварительная обработка препаратов щелочью с последующей двухчасовой инкубацией препарата в двукратном стандартном солевом растворе (2?SSC) при 65 °С. В качестве щелочных растворов обычно применяют гидрат окиси бария или натрия. Окраску препаратов производят красителем Гимза. С-окраска имеет свою кодировку (GBG) по международной цитогенетической номенклатуре. Конститутивный гетерохроматин построен преимущественно из многократно повторяющихся последовательностей ДНК, так называемой сателлитной ДНК, выявляемой во время градиентного центрифугирования хроматина. В популяциях человека, также как и в случае Q-окрашивания, существует межиндивидуальная вариабельность по определенным участкам хромосом, в данном случае по величине блоков С-гетерохроматина, выявляемых с помощью С-окраски (С-полиморфизм хромосом). По локализации выделяют 4 типа С-хроматина:
1) собственно центромерный, присущий всем хромосомам, с относительно небольшими по площади темноокрашенными блоками;
2) более крупные блоки гетерохроматина, располагающиеся в прицентромерных районах длинных плечей аутосом 1, 9 и 16, обладающие четко выраженным межиндивидуальным полиморфизмом;
3) большой блок гетерохроматина дистальной части длинного плеча Y-хромосомы, заметно варьирующий по величине у разных лиц мужского пола;
4) гетерохроматин коротких плеч акроцентрических хромосом.
Метод выявления центромерного гетерохроматина позволяет прежде всего оценить хромосомный полиморфизм четырех хромосом набора – 1, 9, 16 и Y, а также используется в практике клинической цитогенетики для уточнения характера структурных перестроек, затрагивающих данные хромосомы. По международной цитогенетической номенклатуре увеличенные или уменьшенные блоки гетерохроматина обозначаются как qh+ или qh- (h – гетерохроматин). Например, запись кариотипа 46,ХХ,9qh+ означает, что у нормальной женщины имеется вариант хромосомы 9 с большим гетерохроматиновым блоком в длинном плече, а запись 46,XYqh– означает, что у мужчины имеется уменьшение длины гетерохроматинового блока на длинном плече хромосомы.
NOR-окраска (от англ. Nucleolar Organizer Region – Ядрышко-Образующие Районы – ЯОР) или Ag-окраска (серебрение) – применяется для выявления ядрышкообразующих районов, расположенных в коротких плечах (сегмент q12 – спутничная нить) всех 5 пар акроцентрических хромосом человека (13, 14, 15, 21 и 22), с помощью окрашивания солями серебра. Известно, что районы ядрышковых организаторов содержат гены рибосомальной РНК (рРНК). Ряды рРНК транскрипционных единиц располагаются тандемно вдоль ДНК и отделяются друг от друга нетранскрибируемыми последовательностями – спейсерами. Транскрибируемый район и нетранскрибируемый спейсер тандемно повторяются примерно 40 раз в каждой из 5 пар акроцентрических хромосом, составляя около 400 копий рибосомных генов на геном. В настоящее время для визуализации этих районов на метафазных хромосомах применяют метод серебрения Хоуэлла и Блэка, основанный на использовании комбинации 50 % раствора нитрата серебра с желатиновым проявителем окраски в условиях прогревания препаратов при 60 %С. С помощью этого метода сами хромосомы окрашиваются в желтый цвет, а в коротких плечах акроцентрических хромосом на спутничных нитях четко выделяются черные точечные образования – глыбки восстановленного металлического серебра. Размеры этих глыбок, отражающие активность ЯОР, на разных хромосомах существенно варьируют – от отсутствия заметной окраски, до достаточно крупных блоков серебра (Ag-полиморфизм). Тонкие механизмы окраски ядрышкообразующих районов хромосом пока неизвестны, но ясно, что красящим субстратом является не ДНК рибосомных генов и не рРНК, а кислые белки, связанные с ней. Для оценки данного типа хромосомного полиморфизма предложена полуколичественная 5-балльная система оценки активности ЯОР каждой из 5 пар акроцентрических хромосом генома человека (0 – отсутствие окраски, 1 – слабая, 2 – средняя, 3 – сильная, 4 – очень сильная окраска ЯОР хромосом, при которой размеры Ag-блока значительно превышают толщину хроматид). При сложении баллов отдельных ЯОР может быть оценена активность всех 10 ЯОР генома по критерию суммарной функциональной активности ЯОР. В популяциях человека существует межиндивидуальный полиморфизм Ag-окрашенных хромосом, который выражается в специфичности степени окраски отдельных хромосом у разных индивидов, являющейся наследуемой характеристикой.
Т-окраска (от англ. Telomere – теломера) – применяется для выявления теломерных районов хромосом в коротких и длинных плечах.
Презентация была опубликована 3 года назад пользователемнаташа молчанова
Похожие презентации
Презентация на тему: » МЕТОДЫ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО ОКРАШИВАНИЯ. ХРОМОСОМНЫЕ НАРУШЕНИЯ И ИХ ЗНАЧЕНИЯ. Презентацию подготовили Чистякова Кристина и Молчанова Наташа, 101 группа.» — Транскрипт:
1 МЕТОДЫ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО ОКРАШИВАНИЯ. ХРОМОСОМНЫЕ НАРУШЕНИЯ И ИХ ЗНАЧЕНИЯ. Презентацию подготовили Чистякова Кристина и Молчанова Наташа, 101 группа ( олиго) 2017 год
2 Методы дифференциального окрашивания хромосом человека В начале 70-х гг. были разработаны методы дифференциальной окраски хромосом, которые позволяли однозначно идентифицировать каждую хромосому. Методы были основаны на способности некоторых красителей специфически связываться с конкретными участками хромосом в зависимости от их структурно- функциональной организации. Предложенные методы выявляли линейную неоднородность (сегменты) хромосом.
3 Виды методов окраски хромосом Существуют различные методы окрашивания хромосом. Наиболее распространенными являются: рутинная или обычная окраска и ряд методов дифференциального окрашивания хромосом: Q, G, C, NOR или Ag-окраска. Методы дифференцированного окрашивания хромосом приводящие к образованию сегментов вдоль длины всех хромосом (например Q, G, R) приводящие к окрашиванию специфических хромосомных структур, в результате чего выявляется ограниченное число сегментов (С, T, NOR).
4 Схематическое изображение дифференциально окрашенных хромосом человека по G-методу
5 Хромосома при дифференциальной окраске в световом микроскопе (а) и схематическое изображение той же хромосомы (б). В плечах хромосомы видно чередование светлых и темных полос, расположенных симметрично в сестринских хроматидах.
6 На рис. представлены дифференциально окрашенные X и Y- хромосомы с различными уровнями спирализации. Использованный подход дает возможность точно устанавливать точки разрывов в перестроенных хромосомах, даже если в перестройку вовлечены небольшие участки хромосом.
7 Поперечная исчерченность, обнаруживаемая различными методами, в принципе выявляет одни и те же сегменты хромосомы и является результатом неравномерной конденсации хроматина по всей ее длине. В зависимости от степени спирализации ДНК в хромосоме выделяют гетерохроматиновые и эухроматин новыерайоны, для которых характерны различные функциональные и генетические свойства. Гетерохроматиновый район представляет собой участок конденсированного хроматина (высокоспирализованная ДНК), который выявляется при дифференциальном окрашивании в виде темных полос. Присутствие гетерохроматина можно обнаружить и в интерфазном ядре, где он отчетливо выявляется в виде интенсивно окрашенных глыбок хроматина. Считывания генетической информации с данных участков не происходит. Эухроматиновые регионы хромосом в интерфазном ядре не видны, поскольку представлены хроматином в конденсированном состоянии. Это указывает на их высокую метаболическую активность. Действительно, эухроматин новые районы содержат уникальные гены, контролирующие синтез различных белков. При дифференциальном окрашивании метафазных хромосом они определяются как светлые полосы.
8 Виды методов окраски хромосом Существуют различные методы окрашивания хромосом. Наиболее распространенными являются: рутинная или обычная окраска и ряд методов дифференциального окрашивания хромосом: Q, G, C, NOR или Ag-окраска. Методы дифференцированного окрашивания хромосом приводящие к образованию сегментов вдоль длины всех хромосом (например Q, G, R) приводящие к окрашиванию специфических хромосомных структур, в результате чего выявляется ограниченное число сегментов (С, T, NOR).
9 Рутинная окраска Рутинная окраска хромосом достигается путем простого окрашивания полученных хромосомных препаратов красителем Романовского-Гимзе. Это окрашивание приводит к сплошному окрашиванию хромосом по длине, что не позволяет идентифицировать разные морфологически сходные хромосомы набора. Исторически она использовалась первой, но в наше время она практически не применяется для диагностики конституциональных хромосомных нарушений, однако находит применение при анализе хромосомных аберраций в тестировании факторов среды на мутагенную активность.
10 C- окрашивание хромосом Окраска выявляется в виде вариабельных по величине темноокрашенных сегментов конститутивного гетерохроматина в прицентромерных районах хромосом, в то время как эухроматин новые участки хромосом окрашиваются очень бледно. Существуют вариации, но необходимо обрабатывать препаратов щелочью с последующей инкубацией препарата в солевом растворе. Затем окрашивают красителем Гимзе.
11 G- окрашивание хромосом Другая окраска хромосом названа Гимза-окраска которая выявляет G-полосы (G- bands). Выявляется благодаря предварительной обработке хромосомных препаратов слабым раствором протеолитического фермента трипсина и последующей окраске красителем Гимза. При этом наблюдается полосатая исчерченность хромосом, где темные полосы – гетерохроматин, светлые – эухроматин.
13 R-окрашивание хромосом Отличается противоположностью рисунка G- окраске. Темноокрашенные-эухроматин, светлоокрашенные – гетерохроматин. Существует несколько модификаций метода. Наиболее часто применяются обработка препаратов Ba(OH)2 с подогреванием их при 60 градусах и с последующей отмывки в дистиллированной воде и окрашивают красителем Гимзе.
14 T-окраска Применяются для выявления тело мерных районов хромосом в коротких и длинных плечах. Включают инкубацию препаратов хромосом при 87 градусах в растворе фосфатного буфера. Затем окрашивают красителем Гимзе.
15 NOR-окраска Окраска препаратов раствором нитрата серебра, необходима для выявления районов ядрышковых организаторов Применяется для выявления ядрышко образующих районов, расположенных в коротких плечах 5 пар акроцентрических хромосом.
16 Хромосомные нарушения Хромосомы это организованные в виде двойной спирали молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), образующей химическую основу наследственности Хромосомные нарушения: 1. Изменение числа хромосом 2. Изменение структуры хромосом
17 Синдром Дауна Синдром возникает из-за процесса расхождения хромосом при образовании гамет (яйцеклеток и сперматозоидов), в результате чего ребенок получает от матери или от отца лишнюю 21-ю хромосому или ее фрагменты.
18 Синдром Шерешевского Тёрнера Хромосомная болезнь, сопровождающаяся характерными аномалиями физического развития, низкорослостью и половым инфантилизмом. Моносомия по X- хромосоме. Истинными причинами аномалий Х-хромосомы является нарушение мейотического расхождения хромосом, приводящее к анеуплоидии (при Х- моносомии), либо нарушение дробления зиготы.
19 Изменение структуры хромосом 1. Транслокации 2. Делеции 3. Дупликации 4. Инсерции 5. Кольцевые хромосомы 6.Инверсии
20 ХРОМОСОМНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ Делеция Термин «хромосомная делеция» означает, что часть хромосомы утрачена или укорочена. Делеция может случиться в любой хромосоме и на протяжении любой части хромосомы. Делеция может быть любого размера. Если утраченный при делеции материал (гены) содержал важную информацию для организма, то у ребенка могут возникать трудности в обучении, задержка развития и другие проблемы со здоровьем. Тяжесть этих проявлений зависит от размеров утраченной части и локализации внутри хромосомы. Дупликации Термин «хромосомная дупликация» означает, что часть хромосомы удвоена, и из- за этого возникает избыток генетической информации. Этот избыточный материал хромосомы означает, что организм получает слишком большое число «инструкций», и это может привести к трудностям в обучении, задержке развития и другим проблемам здоровья ребенка. Инверсии Хромосомная инверсия означает такое изменение хромосомы, при котором часть хромосомы развернута, и гены в этом участке расположены в обратном порядке. В большинстве случаев носитель инверсии здоров.
21 ХРОМОСОМНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ Инсерции Хромосомная инсерция (вставка) означает, что часть материала хромосомы оказалась «не на своем месте» на этой же или на другой хромосоме. Если общее количество хромосомного материала не изменилось, то такой человек, как правило, здоров. Однако если такое перемещение приводит к изменению количества хромосомного материала, то у человека могут возникать трудности в обучении, задержка развития и другие проблемы здоровья ребенка. Кольцевые хромосомы Термин «кольцевая хромосома» означает, что концы хромосомы соединились, и хромосома приобрела форму кольца. Обычно это происходит, когда оба конца одной и той же хромосомы укорочены. Оставшиеся концы хромосомы становятся «липкими» и соединяются, формируя «кольцо». Последствия формирования кольцевых хромосом для организма зависят от размера делеций на концах хромосомы. Транслокация тип хромосомных мутаций, при которых происходит перенос участка хромосомы на негомологичную хромосому.
22 Используемая литература : [Электронный ресурс] URL: html (Дата обращения : ) html Основы генетики и наследственные нарушения у детей. А.Ю.Асанов, Н.С.Демикова, С.А.Морозов Хромосомные нарушения Синдром Дауна html Синдром Шерешевского-Тернера