За счет чего фрагмент днк вируса оказывается в бактерии
Не только ВИЧ. Как устроены вирусы?
Галина Вирясова
Сайт СПИД.ЦЕНТР немало рассказывает своим читателям о вирусе иммунодефицита человека, но как устроены остальные вирусы? Чтобы помочь увидеть общую картину, наши авторы подготовили небольшой гид по вирусам с объяснением, как они работают, размножаются и как работают противовирусные лекарства.
Одни вирусы способны интегрироваться в геном клетки-мишени и таким образом оставаться во всех дочерних клетках, которые будут в будущем получены после ее деления. К таким вирусам относятся гаммаретровирусы и лентивирусы. Другие делать этого не умеют (например, адено- и аденоассоциированные вирусы). Но для производства белков и репликации (размножения) все они используют клетку и ее синтетический аппарат.
Несмотря на некоторую «несамостоятельность» в размножении, вирусы способны наследовать генетические мутации и подвержены эволюционному отбору. Выживает сильнейший, а в случае вируса — самый устойчивый и заразный.
Как это работает?
Для того чтобы вирус мог проникнуть в клетку, белки его оболочки должны связаться с мембранными белками клетки-мишени. Важно отметить, что проникает вирус только в те клетки, которые могут в дальнейшем помочь его репликации. Вирус ВИЧ живет в клетках иммунной системы, вирус гепатита С — в клетках печени. Есть особые вирусы, которые поражают только растения или даже только бактерии.
В целом у вирусов существуют разные стратегии доставки вирусного материала в клетку. Какие-то вирусы размножаются в ее цитоплазме, а какие-то — в ядре. Некоторые умеют «впрыскивать» свою генетическую информацию прямо через мембрану, когда сам капсид остается снаружи.
Объединяет их одно: после того как вирусная информация доставлена в клетку, та, «забывая» о своей изначальной функции, начинает заниматься в первую очередь репликацией вируса. Клетка производит матричную РНК (мРНК), с которой затем синтезируются вирусные белки и копируется геном, и сама собирает новую вирусную частицу.
В большинстве случаев вирус убивает клетку, чтобы выйти наружу и приступить к поиску новой «жертвы». Но иногда этого не происходит: некоторые вирусы, в том числе ВИЧ, могут отделяться от клетки, обзаведясь собственной оболочкой и оставив клетку в живых, чтобы та продолжила производить новые вирусные частицы.
Содержащие неактивный вирус и оставшиеся в живых клетки иногда сохраняют возможность нормального функционирования. В этом случае клетки могут быть заражены, но вирус проявит себя спустя длительный период времени. Так устроен герпес.
В зависимости от того, каким типом нуклеиновой кислоты представлен генетический материал, выделяют ДНК-содержащие вирусы и РНК-содержащие вирусы. И тут стоит остановиться на классификации.
Типы вирусов. Коротко о главном
Современная типология вирусов содержит 7 классов и была предложена Дэвидом Балтимором еще в 1971 году. С тех пор, впрочем, она была уточнена и расширена, в том числе советскими учеными. И выглядит в настоящее время таким образом:
Вирусы, содержащие двухцепочечную ДНК
Описание
Для репликации вирусу необходимо попасть в ядро клетки-мишени и воспользоваться ее ДНК-полимеразой. Иногда вирус вызывает незапланированное деление самое клетки, то есть становится онкогенным. Эти вирусы хорошо изучены.
Пример: Вирус герпеса, адено- и папилломавирусы
Вирусы, содержащие одноцепочечную ДНК
Описание
Попадая в ядро клетки, вирусы образуют двухцепочечную ДНК, после чего реплицируются так же, как вирусы класса I.
Пример: Парво- и цирковирусы
Вирусы, в которых РНК способна к репликации (редупликации)
Описание
Вирусы этого класса могут размножаться в цитоплазме клетки, им не нужна молекула ДНК. Каждый ген, находящийся в РНК вируса, кодирует только один вирусный белок.
Пример: Бирна- и реовирусы
Вирусы, содержащие одноцепочечную (+) РНК
Описание
Из геномной (+) РНК на рибосомах хозяина создаются вирусные белки. В одном фрагменте РНК могут быть закодированы разные белки, что увеличивает сложность вируса без удлинения генов.
Пример: Пикорнавирусы (полиомиелит, гепатит А) и коронавирусы
Вирусы, содержащие одноцепочечную (–) РНК
Описание
(–) РНК этих вирусов предварительно должна быть транскрибирована в (+) РНК вирусными РНК-полимеразами, после чего может начаться синтез вирусных белков. Вирусы этого класса делятся еще на две группы, в зависимости от их генома и места его репликации (цитоплазма или ядро).
Пример: Филовирусы, аренавирусы (геморрагическая лихорадка Ласса), ортомиксовирусы (вирусы гриппа) и так далее.
Вирусы, содержащие одноцепочечную (+) РНК, реплицирующиеся через стадию ДНК
Описание
Такие вирусы используют фермент обратную транскриптазу для превращения (+) РНК в ДНК, которая встраивается в геном хозяина ферментом интегразой. Дальнейшая репликация происходит при помощи полимераз клетки хозяина.
Пример: Ретровирусы (в том числе ВИЧ)
Вирусы, содержащие двухцепочечную ДНК, реплицирующиеся через стадию одноцепочечной РНК
Описание
Молекула ДНК замкнута в кольцо и является матрицей для синтеза мРНК и дополнительных молекул РНК, которые используются при репликации вирусного генома обратными транскриптазами.
Пример: Колимовирусы (вызывают инфекции растений) и гепаднавирусы (например, гепатит В)
Вакцинация и лечение
Как правило, организмы умеют бороться с паразитирующими на них вирусами. На примере млекопитающих и человека мы обычно говорим о главном инструменте — врожденном иммунитете.
Впрочем, наиболее эффективен этот вид защиты в отношении бактериальных инфекций и не может обеспечить продолжительную и надежную защиту, особенно от инфекций вирусных.
Именно поэтому огромное значение имеет приобретенный иммунитет, в результате которого клетки иммунной системы обучаются вырабатывать специфические к вирусу антитела, способные уничтожать как саму вирусную частицу, так и зараженные ею клетки.
Еще одна врожденная система борьбы с вирусными инфекциями — внутриклеточная. Как правило, клетка способна распознать чужеродную РНК в своей цитоплазме, куда ее сперва и доставляют многие вирусы, и имеет специальные комплексы для ее деградации. Но часть вирусов научились обходить и эту ловушку. К примеру, ротавирусы, которые даже внутри клетки сохраняют капсид с геномной РНК.
С приобретенным иммунитетом тоже не все гладко. Некоторым вирусам, например, ВИЧ, удается избежать иммунного ответа. Другим, например нейротропным вирусам, — уклониться от него, выбрав безопасную среду обитания: они распространяются среди клеток нервной системы, где их не может «достать» иммунная система. Самый известный из таких вирусов — вирус бешенства, который способен проникать в нейроны.
Миссия: уничтожить
Основная сложность в лечении вирусных заболеваний заключается в том, что они используют естественные функции клеток-мишеней для своего размножения, поэтому ученым зачастую оказывается не так-то просто придумать препарат, который будет токсичен для вируса и безопасен для самой клетки. Если такой безопасности достичь не удастся, лекарство будет иметь слишком много побочных эффектов, повреждающих сам организм, что окажется нецелесообразно для использования.
По принципу действия противовирусные препараты подразделяются на две группы: стимулирующие иммунную систему атаковать вирусы (например, за счет индукции синтеза белков-интерферонов) и атакующие вирусы напрямую. Препараты второй группы различаются по этапу жизненного цикла вируса, на котором они активны: это препараты, препятствующие проникновению вируса в клетку, препятствующие размножению вируса внутри клетки и препятствующие выходу копий вируса из клетки.
Чтобы помешать проникновению вируса, препарат должен заблокировать рецептор на клетке, с которым связывается вирусная частица. Так работает, например, ибализумаб — зарегистрированный в США новый препарат против ВИЧ, о котором мы недавно писали.
Такие противовирусные препараты, как уже давно известный ацикловир (им лечат инфекции, вызванные простым вирусом герпеса) или ламивудин (активен против ВИЧ и гепатита В), представляют собой синтетические аналоги нуклеозидов — «букв», из которых состоят нуклеиновые кислоты. Если эти модифицированные, неправильные нуклеозиды попадают в клетку, вирусный геном, в который они оказались встроены, становится непригоден для дальнейшего распространения вируса.
Еще один класс противовирусных препаратов блокирует ферменты, необходимые для создания и модификаций белков вируса. Такие лекарства называют протеазными ингибиторами.
Вместо заключения: а могут ли вирусы приносить пользу?
Безусловно, да. Несмотря на то, что вирусы ассоциируются у большинства людей с однозначным вредом, они могут приносить и пользу — если речь идет о так называемых вирусных векторах и терапевтических подходах на их основе.
Исследователи давно научились помещать в белковую оболочку вируса интересующие их нуклеиновые кислоты, чтобы доставлять нужный ген в клетки, а также убирать те гены, которые делают вирус опасным для организма.
Это позволило сделать возможной генную терапию, помогающую бороться с заболеваниями, вызванными известными генетическими мутациями. Создание вирусных векторов — достаточно непростая задача, к тому же ограниченная свойствами самих вирусных частиц: количеством помещающейся генетической информации, местом ее вставки, стабильностью. Кроме того, вирусный вектор, используемый в медицине, не должен вызывать иммунного ответа или критично влиять на жизнедеятельность клетки. Тем не менее эти сложности решаются, поэтому уже одобрен ряд вполне успешных и безопасных генных терапий. А в качестве основы для вирусных векторов чаще всего используются ретро-, ленти-, адено- и аденоассоциированные вирусы.
Бактериальный иммунитет и система CRISPR/Cas
Бактериальный иммунитет и механизм действия системы CRISPR/Cas
Система специфического адаптивного иммунитета бактерий и архей защищает прокариот от инфицирования вирусами и плазмидами
Бактериофаги против бактерий
Создание современной технологии геномного редактирования, которая уже с успехом применяется на разных животных, растениях, грибах и бактериях, базируется на исследованиях бактериальных систем CRISPR-Cas. Изначально предполагалось, что они участвуют в ликвидации повреждений бактериальной ДНК, но в 2007 г. стало ясно, что истинное предназначение этих систем – борьба с вирусами бактерий, бактериофагами.
Бактериофаги – вирусы, которые при инфицировании прокариот влияют на все процессы жизнедеятельности бактериальной клетки, фактически превращая ее в фабрику по производству вирусного потомства. В конце концов, клетка разрушается, а вновь образованные вирусные частицы выходят наружу и могут заражать новые бактерии.
Несмотря на огромное число и разнообразие природных фагов, встречаемся мы с ними редко. Однако бывают ситуации, когда деятельность этих вирусов не остается незамеченной. Например, на предприятиях, где производят сыры, йогурты и другие кисломолочные продукты, часто приходится сталкиваться с вирусной атакой на бактерии, сбраживающие молоко. В большинстве таких случаев фаговая инфекция распространяется молниеносно, и полезные бактерии гибнут, что приводит к значительным экономическим потерям.
Бактериофаги или фаги (от др.-греч. φᾰγω «пожираю») – вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис. Как правило, бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического материала одноцепочечной или двуцепочечной нуклеиновой кислоты (ДНК или, реже, РНК). Общая численность бактериофагов в природе примерно равна общей численности бактерий. Бактериофаги активно участвуют в круговороте химических веществ и энергии, оказывают заметное влияние на эволюцию микробов и бактерий.
Рис.1. Схема строения вириона фага семейства Myoviridae (слева), и микрофотография фага Т2, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа.
Большинство фагов состоит из головки диаметром 45–140 нм и отростка («хвоста») толщиной 10–40 нм и длиной 100–200 нм (рис. 1).
Взаимодействие с бактериями
Бактериофаги (фаги) – это вирусы, которые в ходе инфекции влияют на все процессы жизнедеятельности бактериальной клетки, фактически превращая ее в фабрику по производству вирусного потомства. В конце концов клетка разрушается, а вновь образованные вирусные частицы выходят наружу и могут заражать новые бактерии.
По характеру действия на бактерии различают вирулентные и умеренные фаги.
Рис.2. Адсорбция фага PIcmlclr 100ts на поверхности Yersinia pestis.
Рис.3. Лизис E. coli и выход фаговых частиц. Справа — зрелая форма бактериофага.
Бактериальный иммунитет
На сегодня известно пять основных, весьма хитроумных механизмов защиты, которые бактерии выработали в непрестанной борьбе с вирусами: изменение рецептора на поверхности клетки; исключение суперинфекции; системы абортивной инфекции; системы рестрикции-модификации и, наконец, системы CRISPR/Cas.
Рис.4. На сегодня известно несколько стратегий, которые бактерии используют в борьбе с вирусами и плазмидами, в результате чего удается либо воспрепятствовать проникновению чужеродной ДНК в бактериальные клетки, либо уничтожить ее уже внутри бактерии. К таким способам защиты относятся изменение бактериальных клеточных рецепторов (1), исключение суперинфекции (множественного заражения) (2), системы рестрикции-модификации, разрушающие всю «чужую» неметилированную ДНК (3). В некоторых случаях бактериальная клетка даже идет на «самоубийство», чтобы ограничить численность вирусного потомства (системы абортивной инфекции) (4). Одним из самых впечатляющих примеров механизмов бактериального иммунитета являются системы CRISPR/Cas, основанные на «запоминании» патогенов (5)
Вирусная атака начинается с прикрепления фага к специфическому рецептору на поверхности бактериальной клетки, но при потере рецептора или изменении в его структуре связывания вируса не происходит. Бактерии могут менять рецепторы в зависимости от окружающих условий, таких как плотность и разнообразие микроорганизмов в среде, а также доступность питательных веществ.
Однако потеря рецепторов не всегда выгодна для бактерии, поскольку они выполняют разнообразные важные функции, например, транспорт питательных веществ или формирование межклеточных контактов. В результате для каждой пары «бактерия-бактериофаг» в ходе эволюции находится оптимальное решение, обеспечивающее приемлемый уровень защиты при сохранении возможности роста бактерий в различных условиях среды.
Следующий защитный механизм – исключение суперинфекции. Для бактериофагов известны два основных пути инфекции: литический, приводящий к быстрой гибели зараженной бактерии с высвобождением вирусного потомства, и затяжной лизогенный путь, когда наследственный материал вируса находится внутри генома бактерии, удваивается только с хозяйской ДНК, не причиняя клетке вреда. Когда клетка находится в состоянии лизогенной инфекции, то, с точки зрения «домашнего» вируса (профага), ее заражение другим вирусом нежелательно.
Действительно, многие вирусы, встроившие свою ДНК в геном клетки, ограничивают вновь проникшего в клетку бактериофага («суперинфекцию») посредством специальных белков-репрессоров, не позволяющих генам «пришельца» работать. А некоторые фаги даже препятствуют другим вирусным частицам проникнуть в инфицированную ими клетку, воздействуя на ее рецепторы. В результате бактерии – носительницы вируса имеют очевидное преимущество по сравнению с незараженными собратьями.
Во время инфекции все ресурсы бактериальной клетки направлены на производство новых вирусных частиц. Если рядом с такой клеткой будут находиться другие уязвимые бактерии, то инфекция быстро распространится и приведет к гибели большинства из них. Однако для таких случаев у бактерии имеются так называемые системы абортивной инфекции, которые приводят ее к запрограммированной гибели. Конечно, этот «альтруистичный» механизм не спасет саму зараженную клетку, но остановит распространение вирусной инфекции, что выгодно для всей популяции. Бактериальные системы абортивной инфекции очень разнообразны, но детали их функционирования пока изучены недостаточно.
В ДНК бактерии, содержащей такую систему, все сайты модифицированы. И если бактерия заражается вирусом, ДНК которого не содержит подобной модификации, рестриктаза защитит от инфекции, разрушив вирусную ДНК. Многие вирусы «борются» с системами рестрикции-модификации, не используя в своих геномах последовательности, узнаваемые рестриктазой, – очевидно, что вирусные варианты с другой стратегией просто не оставили потомства.
Последней и в настоящее время самой интересной системой бактериального иммунитета является система CRISPR-Cas, с помощью которой бактерии способны «записывать» в собственный геном и передавать потомству информацию о фагах, с которыми они сталкивались в течение жизни. Наличие таких «воспоминаний» позволяет распознавать ДНК фага и эффективней противостоять ему при повторных инфекциях.
CRISPR (от англ. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – короткие палиндромные повторы регулярно расположенные группами) – особые локусы бактерий и архей, состоящие из прямых повторяющихся последовательностей, которые разделены уникальными последовательностями (спейсерами). Спейсеры заимствуются из чужеродных генетических элементов, с которыми сталкивается клетка (бактериофагов, плазмид). РНК, транскрибирующиеся с локусов CRISPR, совместно с ассоциированными белакми Cas обеспечивают адаптивный иммунитет за счёт комплементарного связывания РНК с нуклеиновыми кислотами чужеродных элементов и последующего разрушения их белками Cas.
Портрет CRISPR
CRISPR-структуры были найдены у 45% всех известных бактерий и 85% архей [29]. В геномах эукариот и вирусов ничего подобного обнаружено не было. Со временем стало понятно, что CRISPR — это сложная многокомпонентная система, а повторы — только малая часть «айсберга». Из чего же состоит этот айсберг?
СRISPR-структуры чаще располагаются на основной хромосоме (нуклеоиде), но иногда входят в состав плазмид (маленьких кольцевых, автономно реплицирующихся молекул ДНК). Повторы в кассете, как правило, строго совпадают между собой по длине и последовательности нуклеотидов. Лишь последний повтор иногда отличается от канонической последовательности остальных, да и то лишь в нескольких концевых позициях.
Спейсеры в кассете часто равны по длине, но отличаются по последовательности нуклеотидов. Наборы спейсеров у штаммов одного вида тоже могут сильно различаться. Чередующиеся повторы и спейсеры образуют «тело» CRISPR-кассеты. «Головой» служит лидерная последовательность; она задает направление транскрипции кассеты (рис. 6). Средняя длина лидерной последовательности около 400 пар нуклеотидов; она не содержит открытых рамок считывания, т.е. не кодирует белки.
Рис.6. Структура CRISPR-кассеты. Спейсеры, повторы, лидерная последовательность: таков обобщенный портрет геномной CRISPR-структуры.
Лидерные последовательности отличаются высоким содержание аденина (A) и тимина (T). В AT-богатых регионах малая бороздка ДНК более узкая — такая топология служит характерным местом посадки для многих белков, взаимодействующих с ДНК. AT-богатые участки часто встречаются в регуляторных последовательностях и точках начала репликации. Предполагают, что лидерная последовательность регулирует транскрипцию CRISPR-кассеты, а значит и функционирование всей системы [33].
Открытие иммунной системы бактерий. Функция CRISPR
Никто не мог предположить, что практическая возможность лечить генетические болезни человека появится «благодаря» бактериям. В конце 80-х годов японские ученые частично секвенировали геном кишечной палочки и нашли интересный участок, который ничего не кодировал. Этот участок содержал повторяющиеся последовательности ДНК, разделенные вариабельными участками — спейсерами. Наличие протяженного некодирующего участка удивило японцев, так как бактерии экономно относятся к своей ДНК и обычно не несут лишних последовательностей. Позже подобные «кассеты» повторов и спейсеров найдут у большого количества бактерий и архей и назовут CRISPR.
Для бактерий одного вида характерно наличие многочисленных штаммов, которые часто сильно отличаются друг от друга. В некотором смысле штаммы можно рассматривать как аналог рас или пород животных. Один штамм одного и того же вида бактерии может быть совершенно безобидным, а другой — опасным патогеном. У разных штаммов бактерий обнаружилась вариабельность, или полиморфизм, по наличию, отсутствию или порядку спейсеров в CRISPR-кассетах.
Полиморфизм, по наличию, отсутствию или порядку спейсеров в CRISPR-кассетах, значение которого было совершенно неизвестно, стало широко использоваться для типирования штаммов и эпидемиологического анализа. В частности, компания Danisco, занимающаяся производством заквасок для молочной промышленности, стала использовать это свойство для классификации своих коммерческих штаммов. Это было удобно и из патентных соображений, ведь несанкционированное использование типированных штаммов Danisco можно было легко выявить и засудить нарушителей.
В начале 2000-х годов несколько ученых независимо друг от друга сравнили последовательности известных CRISPR-спейсеров с последовательностями ДНК, депонированными в публичные базы данных. Оказалось, что довольно часто последовательности спейсеров были похожи на последовательности вирусов. Это позволило предположить, что CRISPR-кассеты могут нести защитную функцию. Результаты были опубликованы в журналах, находящихся в нижней части научной «табели о рангах», и в общем мало кого заинтересовали. Тогда же были обнаружены Cas-гены, часто расположенные рядом с CRISPR-кассетами. Группа биоинформатика Евгения Кунина предложила довольно детальную гипотетическую схему механизма действия CRISPR/Cas-систем. Согласно их модели, при попадании вируса в клетку он обнаруживается с помощью белка Cas, использующего синтезированную c CRISPR РНК-копию. Если какой-либо фрагмент генома вируса совпал с записанным в спейсере, Cas разрезает вирусную ДНК и запускает цепь реакций, в результате вся ДНК уничтожается.
Рис.7. Схематическое изображение системы CRISPR/Cas (Annual Review of Genetics)
Эти результаты были опубликованы в журнале Science в 2007 году и были первым экспериментальным подтверждением защитного действия CRISPR/Cas-систем, опосредованного последовательностями спейсеров:
Эксперимент с термофильным стрептококком
Молочная промышленность постоянно обеспокоена подверженностью термофильного стрептококка S. thermophilus различным вирусным инфекциям. Неслучайно именно на этом модельном организме проведены ключевые эксперименты по уточнению функции CRISPR-систем.
Если заразить живую культуру Streptococcus thermophilus бактериофагами, то большинство бактерий погибнет, но очень небольшая часть выживет. Чем же выжившие отличаются от изначальной культуры? Оказалось, что их геном стал длиннее на 0.01% за счет того, что в CRISPR-кассету добавились 1–4 новых спейсера [45]. При повторном заражении этой культуры теми же бактериофагами все клоны выживали. Как будто, переболев вирусной инфекцией, бактерия стала немного опытнее и записала себе в «медицинскую карту» что-то важное об этом вирусе, и такая инфекция ей теперь не страшна. Действительно, новые спейсеры оказались комплементарны участкам генома заразившего ее вируса. Получается, что CRISPR-кассета — это история болезней бактерии, а спейсеры соответствуют записям об отдельных инфекциях. Если теперь искусственно вырезать из вирусного генома небольшие фрагменты и вставить их в виде новых спейсеров, то клетка окажется невосприимчива к исходному вирусу, даже если никогда раньше с ним не встречалась. Наблюдение оказалось верным и в обратную сторону: при удалении из CRISPR-кассет спейсеров, подобных последовательностям данного бактриофага, исчезала и устойчивость к нему [45]. Эта серия простых и изящных экспериментов на S. thermophilus полностью подтвердила гипотезу об иммунной функции CRISPR-систем. Благодаря полярной манере включения новых спейсеров, CRISPR-кассеты можно буквально читать как историю взаимоотношений прокариот и их вирусов на определённом эволюционном промежутке. CRISPR — это не только иммунитет, но ещё и память о недавних победах прокариотической клетки.
Что же происходит дальше с выжившей бактерией и вновь встроенным спейсером? По своему происхождению он полностью совпадает с участком фагового генома (протоспейсером) и обеспечивает полную защиту. Если клеток с таким спейсером много, то вирус вряд ли преуспеет в заражении большого числа бактерий и не сможет размножиться в массовых количествах, а, значит, вымрет. Не случись повторного заражения тем же вирусом, спейсер в кассете долго не задержится: со временем он будет утерян в результате рекомбинации между повторами кассеты.
Заметим, что вирус тоже не бездействует — он умеет «убегать» от CRISPR-иммунитета, накапливая точечные мутации в последовательности протоспейсера. Интересно, что единичные замены в некоторых из них сразу лишают бактерию устойчивости к вирусу, замены в других лишь несколько ослабляют ее. В любом случае, когда протоспейсер теряет сходство с бактериальным спейсером, как злоумышленник, сделавший серию пластических операций, становится непохож на себя, пропадает и устойчивость. Теперь клетку при заражения спасет только встраивание нового спейсера.
Механизм работы CRISPR/Cas-системы
В нашем организме, после того, как мы переболели какой-то болезнью, остаются клетки памяти иммунной системы, которые при повторном попадании в организм вредителей активизируются и помогают ускоренно справиться с ними. Бактерии справляются со своими патогенами с помощью аналогичной «системы памяти»: CRISPR/Cas-системы обеспечивают иммунитет бактерий и архей против вирусов и плазмид.
Краткое описание работы системы CRISPR/Cas:
Рис.8. При формировании адаптивного иммунитета бактерий бактериальные белки Cas1 и Cas2 встраивают фрагменты вирусной ДНК в качестве спейсеров в CRISPR-кассету, в которой соседние спейсеры отделены друг от друга повторами ДНК (Nuñez et al., 2014, 2015a, b). CRISPR-кассета транскрибируется с образованием длинной некодирующей РНК. Специальные белки Cas, а также, в некоторых случаях, другие белки бактерии нарезают эту РНК на короткие криспрРНК (крРНК или crРНК), каждая из которых содержит один спейсер и часть повтора. В ходе интерференции белки Cas вместе с крРНК образуют эффекторный комплекс, который сканирует ДНК клетки в поисках последовательностей, соответствующих спейсеру крРНК, и разрезает их (Westra et al., 2012; Jinek et al., 2012)
Системы CRISPR/Cas I и II типа
Наиболее изученной является система CRISPR/Cas I типа, которой обладает излюбленный объект молекулярно-биологических исследований – бактерия кишечная палочка (Esсherichia coli). Эффекторный комплекс в этой системе состоит из нескольких небольших белков Cas, каждый из которых отвечает за разные функции: разрезание длинной некодирующей CRISPR РНК, связывание коротких крРНК, поиск, а затем разрезание ДНК-мишени.
В системах II типа эффекторный комплекс образован единственным большим белком Cas9, который в одиночку справляется со всеми задачами. Именно простота и относительная компактность таких систем послужили основой для разработки технологии редактирования ДНК. Согласно этому методу, в клетки эукариот (например, человека) доставляют бактериальный белок Сas9 и крРНК, которую называют гидовой (гРНК). Вместо спейсера вирусного происхождения такая гРНК содержит целевую последовательность, соответствующую интересному для исследователя участку генома, например, где есть мутация, вызывающая какую-то болезнь. Получить же гРНК «на любой вкус» совсем несложно.
Эффекторный комплекс Cas9-гРНК вносит двуцепочечный разрыв в последовательность ДНК, точно соответствующую «гидовой» РНК. Если вместе с Cas9 и гРНК внести в клетку и последовательность ДНК, не содержащую мутацию, то место разрыва будет восстановлено по матрице «правильной» копии! Таким образом, используя разные гРНК, можно исправлять нежелательные мутации или вводить направленные изменения в гены-мишени.
Итак, защитный комплекс CRISPR/Cas9 состоит из:
Рис.9. Схема работы комплекса Cas-РНК и CRISPR кассеты.
Несмотря на то, что в природе две РНК системы Cas9 разделены, учёные показали, что химерная РНК, представляющая собой сшитые в одну цепь вышеуказанные РНК, так же способна направлять Cas9 к ДНК-мишени. Более того, при соблюдении ряда условий можно менять последовательность первой внутри химерной РНК так, чтобы нацеливать Cas9 на желаемые гены.
Молекулярные механизмы работы CRISPR/Cas
Какие молекулярные механизмы обеспечивают CRISPR-опосредованный иммунитет? Правильнее говорить о работе CRISPR/Cas-системы. Ведь только за счет сложных белковых машин из Cas-белков CRISPR-кассетам и удается реализовать защитную функцию. CRISPR/Cas-система работает в три такта: 1) адаптация, или приобретение новых спейсеров; 2) созревание эффекторных комплексов; 3) иммунный ответ, то есть разрушение чужеродной ДНК.
Адаптация.
Когда клетку с CRISPR-системой заражает вирус, из его генома вырезается небольшой фрагмент и встраивается в кассету в качестве спейсера [45]. При повторных заражениях одним и тем же агентом включение первого спейсера, особенно если он из-за случайных мутаций не обеспечивает полной защиты, ускоряет приобретение дополнительных спейсеров против того же самого чужеродного репликона. Это явление назвали праймированием [46]. Несколько спейсеров повышают шансы справиться с инфицирующим агентом даже при неполном совпадении спейсеров и протоспейсеров. Лидерная последовательность — это «точка роста» CRISPR-кассеты. С ней взаимодействуют белковые машины, отвечающие за включение новых спейсеров. Без лидерной последовательности кассеты не могут расти [47] (рис. 10).
Рис.10. Включение новых спейсеров в кассету
Привилегированных вирусных и плазмидных генов, служащих источником протоспейсеров, нет, однако это не совсем случайные последовательности. В вирусных геномах рядом с протоспейсерами находятся короткие, обычно длиной в два-три нуклеотида, PAM-мотивы (от. англ. protospacer adjacent motif) [48]. Это участки связывания белков, важных для выщепления протоспейсера и своеобразные подсказки для CRISPR-системы, что найденный спейсером участок относится к чужеродной ДНК.
Ключевые игроки на стадии приобретения новых спейсеров — белки Cas1 и Cas2 [49]. В некоторых случаях они даже слиты для удобства в один белок. Такая белковая машина работает последовательно: сканирует чужеродную ДНК в поисках PAM-последовательности; вырезает протоспейсер; распознает лидерную последовательность и вставляет новый спейсер с дополнительной копией повтора рядом с ней (рис. 10).
Созревание эффекторных комплексов.
Прим. ред.: Напомним, что в системах CRISPR/Cas II типа эффекторный комплекс образован единственным большим белком Cas9, который в одиночку справляется со всеми задачами.
Рисунок 11. Структура Cascade-комплекса.
Комплекс из Cas-белков нарезает длинный первичный РНК-предшественник на короткие РНК (CRISPR-РНК или, кратко, crРНК), соответствующие последовательности одного спейсера, обрамленной неравными по длине участками повторов [50] (рис. 12). Субъединицы белкового комплекса расположены в пространстве так, что между ними образуется спиральная бороздка, в которую вкладывается crРНК. Cas-белки с намотанной на них crРНК составляют готовый к сражениям эффекторный комплекс.
Рисунок 12. Созревание эффекторных комплексов.
Иммунный ответ.
Правильно сориентированная сrРНК в составе комплекса может комплементарно взаимодействовать с протоспейсером в вирусной или плазмидной ДНК. Только этого мало: нужно не просто узнать чужеродную ДНК, но и уничтожить ее. У E. coliза это отвечает эндонуклеаза Cas3. Она может резать как одноцепочечную, так и двухцепочечную ДНК. Cas3 разрезает ДНК очень эффективно, но совсем не специфично. Эффекторные Cas-crРНК-комплексы, напротив, очень специфично узнают последовательности, комплементарные спейсеру, изменяют свою конформацию и только после этого рекрутируют и правильным образом усаживают на ДНК белок Cas3 [52]. Особенно важны для такого узнавания семь нуклеотидов на границе протоспейсера и PAM-мотива — якорный участок. Если между ним и сrРНК есть различия хотя бы в один нуклеотид, то CRISPR-иммунитет не сработает. Единичные отличия crРНК от протоспейсера вне этой области допускаются и уже не так драматически влияют на успех CRISPR-иммунитета. По мере накопления одноцепочечных разрывов в ДНК-мишени, сродство эффекторного комплекса к ней снижается: он отсоединяется и распадается на отдельные субъединицы. Cas3 вносит большое число разрывов, начиная с места посадки и далее в более или менее случайной манере, кроша ДНК-интервента (рис. 13). Возможно, короткие фрагменты ДНК, образованные в результате работы Cas3, служат заготовками для новых спейсеров. Такая преемственность между циклами работы CRISPR/Cas-систем могла бы объяснять эффект праймирования [46]. Описанный молекулярный сценарий позволяет CRISPR-системам нейтрализовать вирусные инфекции, предотвращать трансформацию плазмидами, нарушать процесс лизогенизации (перехода вирусов в покоящееся состояние за счет встраивания своего генома в геном прокариота-хозяина), а также препятствовать индукции провирусов (переходу покоящихся вирусов, интегрированных в геном, в активное состояние). Изначально считалось, что CRISPR-системы уничтожают только ДНК. Однако позднее открыли архейные CRISPR/Cas-системы, эффективные против вирусов с РНК-геномами [53].
Рис.13. Деградация чужеродной ДНК эффекторными комплексами CRISPR-систем.
«Гонка вооружений» между вирусами и бактериями
В ходе эволюции бактерии и бактериофаги выработали ряд приспособлений, которые должны обеспечить каждому из участников «гонки вооружений» преимущество в борьбе с противником или возможность уклониться от его атаки.
Что касается систем CRISPR-Cas, то если фаг обзаведется мутацией в протоспейсере, эффективность его узнавания эффекторным комплексом снижается, и фаг получает возможность заразить клетку. Но и бактерия не оставит без внимания такую попытку ускользнуть от CRISPR-Cas: в качестве ответной реакции она начинает с резко возросшей эффективностью приобретать новые дополнительные спейсеры из ДНК уже «знакомого» фага, пусть и мутировавшего. Такое явление, названное праймированной адаптацией, многократно повышает эффективность защитного действия систем CRISPR-Cas (Datsenko et al., 2012).
Разработка технологии CRISPR/Cas9
Исходные системы, предсказанные учеными, кодировали большое количество Cas-белков, необходимых для бактериальной защиты. Но также был обнаружен класс систем, которые кодировали только один Cas-белок, правда очень большой. Защитное действие таких систем было продемонстрировано французской исследовательницей Эммануэль Шарпентье. Если в стандартных системах несколько белков собираются в сложный комплекс, связывающий CRISPR РНК, а затем этот комплекс узнает вирусную ДНК-мишень и привлекает еще один белок, «кусающий» вирусную ДНК, то в системе, которую повезло изучать Шарпентье, один белок, получивший название Cas9, выполняет все эти функции: и связывает CRISPR РНК, и узнает мишень, и «раскусывает» ее.
В 2012 году группы Шарпентье и Дженнифер Дудны из Университета Беркли опубликовали совместную статью в Science, где предложили способ перепрограммирования системы CRISPR/Cas таким образом, чтобы она стала направленно разрезать ДНК в участках, целенаправленно выбранных исследователем. В природе CRISPR РНК кодируется в CRISPR-кассете, связывается белками и потом узнает мишень. Оказалось, что можно получать неприродную CRISPR РНК с помощью химического или ферментативного синтеза. При этом место спейсера в такой РНК занимает последовательность, выбранная исследователем. Белок Cas9 способен «узнать» и связаться с такой синтетической СRISPR РНК (ее называют «гид») и становится запрограммированным на узнавание и разрезание соответствующего ей места в ДНК. Группы Шарпентье и Дудны продемонстрировали возможность такого подхода in vitro, то есть в пробирке.
Практически в это же время группы Джорджа Черча и его бывшего аспиранта Фенга Жанга (Feng Zhang) из Института Броуда в MIT показали, что бактериальный белок Cas9 и гид РНК способны «работать», узнавать и направленно разрезать ДНК в клетках высших организмов, в частности человека. MIT успел подать заявку на патент на день раньше, чем Беркли. С тех пор между двумя университетами начались патентные войны, которые продолжаются до сих пор.
Механизм геномного редактирования с помощью CRISPR/Cas9
Рис.14. Система CRISPR-Cas, используемая для редактирования генома, включает в себя гидовую РНК (гРНК) и белок Cas9. С помощью белка Cas9 гРНК присоединяется к протоспейсеру – участку вирусной ДНК, соответствующему спейсеру гРНК (либо, в случае искусственной системы, участку целевого гена эукариотической клетки). После узнавания белок Cas9 разрезает цепь ДНК в одном строго определенном месте. Репарация ДНК в месте разреза может происходить по пути негомологичного соединения концов, в результате чего с большой частотой возникают мутации (а). Если же в клетку доставить искусственно синтезированную донорcкую молекулу, которая соответствует участку разрыва, то таким образом можно произвести либо замену участка гена (б), либо направленную встройку трансгена (в). Таким образом, с помощью системы CRISPR-Cas можно исправлять генетические нарушения или вносить желаемые изменения.
Для того чтобы вылечить генетическую болезнь, нужно исправить генетическую информацию, затронутую мутацией. Гемофилия, как и большинство генетических болезней, вызвана изменением только одной буквы ДНК, а всего в нашем геноме 6 миллиардов букв. Это тысячи книг размером с «Войну и мир». Мы должны найти только одну «опечатку» и исправить ее в заданном месте, не изменив ничего больше. Это и есть задача геномной медицины.
Видео : Редактирование генома с помощью системы CRISPR-Cas9
Чтобы исправить «неправильный» ген, нам нужен очень точный молекулярный «скальпель», который найдет мутантную последовательность нуклеотидов и сможет «вырезать» ее из ДНК. Таким «скальпелем» и является Cas9. С помощью гида РНК, последовательность которой совпадает с искомым местом, он может внести разрыв в нужное место генома. Узнавание мишени происходит на участке длиной в 20–30 нуклеотидов. В среднем последовательности такой длины встречаются в геноме человека единожды, что позволяет обеспечить точность. Клетка не умрет от внесения разрыва в ДНК, так как он будет исправлен по здоровой копии из парной хромосомы за счет естественного процесса репарации ДНК. Если парной хромосомы нет, как в случае гемофилии, можно внести в клетку участок «правильного» гена одновременно с Cas9 и РНК-гидом и использовать его как матрицу для залечивания внесенного разрыва.
С помощью CRISPR/Cas9 можно делать мультиплексное редактирование сразу нескольких неправильных генов. Для этого достаточно ввести белок Cas9 и несколько разных РНК-гидов. Каждый из них направит Cas9 к собственной мишени, и вместе они устранят генетическую проблему.
В целом описанный механизм функционирует за счет принципа комплементарности, который впервые был предложен Джимом Уотсоном и Френсисом Криком в их знаменитой модели двуцепочечной ДНК. Цепочки двойной спирали ДНК «узнают» друг друга по правилам комплементарности. CRISPR РНК узнает свои мишени в двуцепочечной ДНК таким же образом, при этом образуется необычная структура, содержащая двуцепочечный участок взаимокомплементарных РНК и одной из цепей ДНК-мишени, а другая цепь ДНК оказывается «вытесненной».
CRISPR/Cas9 в лечении наследственных заболеваний
См. дополнительно:
Литература:
ССЫЛКИ К РАЗДЕЛУ О ПРЕПАРАТАХ ПРОБИОТИКАХ