Для периодического культивирования характерно что

Периодическое культивирование.

Периодическим (стационарным) называют такой метод культивирования, когда клетки микроорганизмов вносят в питательную среду и далее компоненты среды не поступают в сосуд и не удаляются из него.

Периодическое культивирование микроорганизмов представляет с точки зрения техники наиболее простой метод культивирования. Под культивированием микроорганизмов понимают их выращивание в наиболее благоприятных (оптимальных) условиях.

В простой гомогенной периодической культуре все ее части находятся в одинаковых условиях. Для феноменологического описания роста микроорганизмов в периодическом режиме обычно используют кривую роста (рис. 21). Она имеет S-образный характер. Различные фазы роста такой культуры отражают изменения в биомассе и в окружающей среде. Продолжительность каждого периода зависит от вида культуры, количества и качества посевного материала, состава питательной среды и условий культивирования.

Рисунок21. Фазы на кривой роста периодической культуры: I – лаг-фаза; II – фаза ускорения роста; III – фаза экспоненциального роста; IV – фаза замедления роста; V – стационарная фаза; VI – фаза отмирания.

II фаза называется фазой ускорения роста, она характеризуется началом деления клеток, увеличением общей массы популяции и постоянным увеличение скорости роста культуры; обычно она непродолжительна.

Далее следует экспоненциальная фаза, в наибольшей степени характеризующая и выражающая способность культуры к размножению. В этой фазе сведены к минимуму все лимитирующие и ингибирующие влияния. Компоненты питательной среды имеются в избытке, продукты обмена еще не накопились. Рост идет с максимально возможной скоростью, генетически заложенной в клетке, интервалы между появлением предыдущего и последующего поколений постоянны. Логарифм числа клеток линейно зависит от времени. Если же среда по своему начальному составу не оптимальна, то рост будет ограничен неподходящим питанием или неоптимальным значением рН и т. п. В этом случае рост может быть описан более пологой экспонентой или прямой. Эта фаза в лабораторных условиях не может быть длительной, так как даже не очень плотная популяция вскоре начнёт испытывать недостаток в кислороде из-за его быстрого поглощения и слабой растворимости.

Фаза замедления роста может быть очень разнообразной и самой сложной. Она может полностью отсутствовать на простых синтетических средах, когда рост сразу останавливается из-за отсутствия одного элемента питания, в особенности – источника углерода и энергии. Рост клеток прекращается, и наступает стационарная фаза, в данном случае – фаза голодания по использованному элементу питания. Возникает и пространственная ограниченность, клетки мешают друг другу, уменьшаются поверхности их контакта со средой, ухудшаются поступление питательных веществ внутрь клетки и выброс продуктов метаболизма. На сложных средах, содержащих несколько источников углерода, может происходить поочередная их утилизация и постепенное замедление роста. При избытке питания рост замедляется из-за накопления продуктов метаболизма. Токсичные продукты метаболизма у микроорганизмов весьма разнообразны. Возможно одновременное отравление и голодание. В соответствии с этим и стационарная фаза может содержать самые разнокачественные клетки: живые, но голодающие, живые, но ингибированные, отмирающие по причине голодания или отравления.

Стационарная фаза не характеризует культуру, так как в этот период состояние клеток может быть самым разнообразным. Масса и количество всех живых клеток во время этой фазы достигают своего максимума. Количество вновь образовавшихся клеток становится на этом этапе равным количеству клеток, отмерших и автолизовавшихся. В какой-то момент это равновесие нарушается, и количество отмерших клеток становится больше вновь образовавшихся, наступает VI фаза – фаза отмирания. На этой стадии масса живых клеток значительно уменьшается, так как запасные вещества клетки исчерпываются.

Только экспоненциальная фаза до некоторой степени характеризует свойства культуры.

Таким образом, клетки периодической культуры претерпевают значительные изменения всех свойств по всему периоду роста, обусловленные непрерывными изменениями окружающей среда и быстрой реакцией на них клеток. Тем не менее, периодические методы культивирования микроорганизмов широко используются в настоящее время в промышленной биотехнологии и исследовательской практике. Техника периодической культуры позволяет получить исходные данные, и расходные коэффициенты, и кинетические характеристики культуры, необходимые для перехода к проточным системам и масштабированию процесса.

Источник

Периодическое культивирование микроорганизмов

В периодическом состоянии динамика роста и размножения микро­организмов в жидкой питательной среде обладает рядом особенностей, общих для бактерий, актиномицетов, микроскопических грибов, микоплазм и других про- и эукариот. При индивидуальном развитии им свойственна высокая скорость размножения. Развитие происходит в виде последовательных фаз, характер и продолжительность которых зависят от физиологического состояния клеток, определяемого в свою очередь условиями разнообразных факторов среды, в которой разви­ваются популяция того или иного организма.

Другими словами, фазы роста микроорганизма отражают количест­венные и качественные изменения в их биомассе и окружающей среде.

В простой гомогенной периодической культуре микроорганизмов выделяют от 4 до 8, и даже до 16 фаз.

1. Исходная фаза (лаг-фаза или индукционный период) являет­ся фазой задержки роста, когда размножения микробных клеток не происходит. Эта фаза характеризуется отсутствием роста клеток. В этот период посевная культура приспосабливается к изменившимся внешним условиям и вырабатывает ферменты, необходимые для роста на данной питательной среде. В лаг-фазе в клетках культуры происхо­дят значительные качественные изменения: возрастет количество нук­леиновых кислот, в первую очередь РНК, активизируются одни фер­менты и синтезируются другие.

Продолжительность лаг-фазы зависит от следующих факторов:

— от качества посевного материала

количества в нем жизнеспо­собных клеток, их возраста, способа хранения;

2. Период положительного ускорения роста. Длительность этого периода для большинства микроорганизмов составляет 2 часа, и она зависит от температуры, состава питательной среды, качества посевно­го материала. Многие авторы эти две фазы рассматривают вместе. Число клеток остаётся постоянным из-за отсутствия в этот период кле­точного деления. Общее состояние микробных клеток характеризуется как состояние приспособления к питательной среде. В этот период усиливается синтез веществ, клеток, они увеличиваются в размере, в них образуется большое количество индуцибельных ферментов.

3. Фаза логарифмического (лог-фаза) или экспоненциального (показательного) роста. Она характеризуется постоянной и макси­мальной скоростью роста клеток. Рост микробов в эту фазу происхо­дит в геометрической прогрессии.

Продолжительность этой фазы зависит:

— от запаса питательных веществ в среде;

— от условий аэрации;

— от перемешивания и др. факторов.

На продолжительность генераций влияют температура, рН среды, состав среды и т. д.

Логарифмируя это выражение получим: lg А_t == lg Ао + п lg 2.

Количество клеток в момент to и t определяют подсчетом в камере Горяева с помощью автоматических счетчиков, используемых для подсчета форменных элементов крови типа Целлоскоп или Каултера, или спектро-фотометрически (турдиметрически или нефелометрически). Однако с помощью этих методов определяются как живые, так и мертвые клетки.

В некоторых случаях проводят подсчет только живых клеток. Для этого производят высев клеток на плотные питательные среды с по­следующим подсчетом числа колоний, образуемых жизнеспособными клетками.

Из приведенного уравнения можно рассчитать количество делений клеток и константу скорости деления (V) — число клеточных делений в 1 час.

Рассмотрим конкретный пример. В питательную среду внесли 1000 (10 3 ) клеток. Через 10 часов культивирования в среде выявили 10 9 (1 миллиард) микробных клеток.

Константа скорости деления (число клеточных делений в час) рав­на:

Ig10 9 – lgl0 3 9-3 6

0,3010×10 0,3010×10 3,010

Число клеточных делений равно:

Время, необходимое для одного клеточного деления (t_n),или время генерации:

Эти данные используют при выборе производственных штаммов и для их объективной оценки. Рост периодической культуры можно проследить не только по чис­лу клеток, но и по урожаю клеток. Под урожаем понимают разность между полученной и исходной массами бактерий. Массу выражают в граммах сухого вещества. Это имеет производственное значение, т.к. рост микробной клетки сопровождается не только делением клеток, но и увеличением размеров и массы одной конкретной особи между дву­мя делениями.

Еще одним важным производственным показателем характеристи­ки штаммов бактерий является скорость экспоненциального роста. Для ее расчета используют показатель плотности бактериальной суспен­зии. Это связано с тем, что константа скорости роста и константа ско­рости деления клеток не равноценны, т.к. число и масса клеток не идентичные понятия и во время роста периодической культуры соот­ношение между этими двумя показателями изменяется.

t- время культивирования, час; lg e == 0,43429.

Время удвоения клеточной массы t_d можно рассчитать по формуле:

С экономической точки зрения важным показателем процесса культивирования является показатель, называемый экономическим коэффициентом. Если обозначить его через букву Y, его можно рас­считать по формуле:

Высокая скорость развития микроорганизмов сохраняется на всей экспоненциальной стадии. Однако эта зависимость наблюдается в те­чение ограниченного времени. По мере роста культуры в среде посте­пенно потребляются питательные вещества, накапливаются продукты обмена, затрудняется транспорт питательных веществ (в первую оче­редь кислорода) и метаболитов вследствие увеличения плотности по­пуляции.

4. Фаза отрицательного ускорения. В эту фазу скорость размно­жения замедляется, а время генерации увеличивается. Наступление этой фазы обусловлено истощением питательной среды и накоплением в культуральной жидкости токсических веществ, которые начинают ингибировать развитие культуры. Кроме того, в эту фазу происходит наивысшее накопление микробной массы в единице объёма.

5. Стационарная фаза роста, или максимума, на протяжении ко­торой численность микробной популяции не уменьшается. В эту фазу скорость размножения и отмирания клеток одинаковая. Концентрация живых клеток в эту фазу достигает максимума, и она называется М-концентрацией. В этой фазе сама биомасса микроорганизмов и про­дукты их биосинтеза обладают наибольшей биотехнологической цен­ностью.

6. Фаза отмирания микробной популяции. Любая микробная популяция, растущая в сосуде с несменяемой средой, вступает после фазы стационарного роста в стадию отмирания. По скорости отмира­ния вначале устанавливают фазу ускоренного отмирания (VI), затем фазу постоянной скорости отмирания (VII) и фазу замедленной скоро­сти отмирания (VIII). Причинами отмирания микробной популяции являются истощение среды и накопление в ней большого количества токсических продуктов метаболизма. В период стадии отмирания об­щее количество биомассы уменьшается, что чаще всего происходит за счет аутолиза.

Продолжительность стадии отмирания у различных микроорганиз­мов не одинакова: у пневмококка она составляет 2-3 суток, у эшери-хий — несколько месяцев. В этот период в культуре находят значитель­ное уменьшение клеток. У них уменьшается биохимическая и анти­генная активность.

Учитывая это для изготовления ряда биопрепаратов отбирают культуры микроорганизмов чаще всего в фазе отрицательного ускоре­ния роста, или в начале стационарной фазы роста, когда концентрация живых микробных клеток приближается или равна М-концентрации.

Хемостатная культура, или метод непрерывного культивирования микроорганизмов

Хемостатная, или непрерывная, культура представляет собой проч­ную культуру тех или иных микроорганизмов. В таком случае воз­можность продления жизни микробной популяции поддерживается с помощью непрерывной подачи свежей среды и постоянного отбора микробной биомассы или образовавшихся продуктов метаболизма, т.е. можно культуру микроорганизма как бы зафиксировать в одной, например стационарной, фазе роста и получать нужные продукты об­мена или биомассу во времени столько, сколько требуется. Таким об­разом, максимальная производительность в хемостатной культуре все­гда выше, чем максимальная производительность в периодической культуре.

Нужно сказать, что до 50-х годов для культивирования микроорга­низмов с целью их всестороннего изучения служила простая периоди­ческая культура. Только с переходом к методу хемостатного культи­вирования обнаружился недостаток периодической культуры, которая не даёт полного представления обо всех изменениях, происходящих в клетке, и о влиянии внешних факторов на протекающие в ней процес­сы.

Развитие хемостатного культивирования открыло возможность управлять процессом, контролируя рост и поведение микроорганиз­мов, а при необходимости вмешиваться в этот процесс, изменяя ско­рость роста до задаваемых пределов путём воздействия на такую куль­туру внешними факторами. В настоящее время интерес к непрерывно­му культивированию растёт как в нашей стране, так и за рубежом. Од­нако, несмотря на преимущества хемостатных культур, в биологиче­ской промышленности при производстве вакцин они не получили ещё достаточного применения по следующим причинам:

1. Технические трудности, в первую очередь связанные с создани­ем асептических условий.

2. Не во всех случаях непрерывный процесс предпочтительнее пе­риодического, поскольку при низкой удельной скорости роста биомас­сы периодический процесс по эффективности не уступает непрерыв­ному и более выгоден, т. к. его проще осуществить.

3. Интенсивный биосинтез многих продуктов метаболизма проис­ходит при медленном росте биомассы, поэтому в периодических про­цессах концентрация целевого продукта в культуральной жидкости обычно выше, чем в непрерывных, что существенно повышает эффек­тивность стадий выделения и очистки продукта. Всё это свидетельствует о том, что периодические процессы в бу­дущем будут применяться.

Дата добавления: 2016-05-11 ; просмотров: 6505 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Источник

Культивирование микроорганизмов.

В мире существует два основных способа культивирования микроорганизмов: периодическое (статическое) и непрерывное (проточное).

Периодическое (статическое) культивирование

Рост бактерий в периодической культуре происходит до тех пор, пока содержание какого-нибудь из компонентов питательной среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов метаболизма, то получим так называемую периодическую культуру (популяцию клеток в ограниченном жизненном пространстве).

Сл. 8. Изменение численности популяции клеток при периодическом культивировании имеет определенную закономерность. Если по оси абсцисс отложить время, а по оси ординат – логарифм числа жизнеспособных клеток, то можно построить кривую роста бактерий. Типичная кривая роста имеет S- образную форму. Анализируя кривую можно различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности:

Начальную или лаг-фазу;

Экспоненциальную или логарифмическую фазу;

Стационарную фазу;

Фазу отмирания.

Кривая роста бактериальной культуры:

1) лаг-фаза; 2) экспоненциальная фаза;

3) стационарная фаза; 4) фаза отмирания.

Лаг-фаза включает период от посева бактерий на свежую питательную среду до достижения ими максимальной скорости роста. В начале лаг-фазы бактерии приспосабливаются к новым условиям. В клетках идет синтез ферментов, нуклеиновых кислот, белков, активируются обменные процессы. Клетки интенсивно растут, и размеры их заметно увеличиваются. Деления бактерий на этой стадии практически не происходит. Длительность этой фазы зависит от полноценности питательной среды и от состояния культуры микроорганизма. Чем полноценнее питательная среда и чем моложе культура бактерий, тем короче лаг-фаза.

Экспоненциальная фаза характеризуется активным делением подавляющей массы клеток бактериальной популяции. Число клеток возрастает в геометрической прогрессии. Характеризуется постоянной максимальной скоростью или скоростью роста. Эта скорость зависит от вида бактерий. Бактерии E. coli при 37 0 С делятся каждые 20 мин, а бактерии родов Nitrosomonas и Nitrobacter – 5-10 часов.

Во время этой фазы клетки имеют приблизительно равный размер, содержание белка в них тоже постоянно. Клетки содержат максимальное количество РНК. Клетки на этой фазе наиболее жизнеспособны и обладают высокой биохимической активностью.

Стационарная фаза наступает тогда, когда число живых клеток достигает максимума и перестает увеличиваться, так как скорость размножения бактерий равна скорости их отмирания. Так как скорость роста зависит от концентрации субстрата, то при уменьшении этой концентрации, еще до полного использования субстрата, она начинает снижаться. Скорость роста может снижаться не только из-за нехватки субстрата, но также из-за большой плотности бактериальной популяции, из-за низкого парциального давления О₂ или накопления токсичных продуктов обмена. Клетоки по химическому составу отличается от состава клеток в экспоненциальной фазе. Клетки в стационарной фазе меньше по размеру, содержат меньше РНК, более устойчивы к физическим воздействиям и химическим агентам, чем в экспоненциальной фазе роста культур. В этот период в клетках и в среде нередко накапливаются продукты вторичного метаболизма (антибиотики, пигменты, бактериоцины и др.). Продолжительность этой фазы от нескольких часов до недели в зависимости от вида микроорганизмов.

В стационарную фазу роста поведение клеток бактериальной популяции регулирует такое явление как апоптоз. Суть его сводится к тому, что при исчерпании питательного субстрата голодающая популяция разделяется на две субпопуляции, одна из которых гибнет и подвергается автолизу, а клетки другой субпопуляции, используя продукты автолиза как субстрат, продолжают размножаться.

В фазе отмиранияпроисходит снижение числа живых клеток. Скорость отмирания бактерий широко варьирует в за­висимости от условий и особенностей организма. Например, энтеробактерии отмирают медленно в отличие от некоторых видов бактерий рода Bacillus, которые отмирают быстро. Причины отмирания клеток могут быть разными. Это и накопление органических кислот (как у бактерий родов Escherichia. Lactobacillus), автолиз (лизис под дейст­вием собственных ферментов), накопление антибиотиков, бактериоцинов и другие причины. Сл. 9

Непрерывное проточное культивирование заключается в том, что в сосуд, содержащий популяцию бактерий, периодически подается свежая питательная среда и одновременно удаляется из него избыток среды с клетками микроорганизмов. Это позволяет задержать культуру в состоянии экспоненциального роста.

Проточное культивирование осуществляется в аппаратах двух типов: хемостатах и турбидостатах.

В хемостатах рост бактериальной популяции контролируется концентрацией питательного субстрата по источнику углерода и азота. Для равномерного распределения питательных веществ содержимое культиватора механически перемешивается и аэрируется стерильным воздухом. Излишняя микробная масса с питательной средой через сливной сифон вытекает из культиватора.

Турбидостат – это тот же хемостат, но снабженный фотоэлекрическим элементом, регистрирующим мутность среды. Когда плотность биомассы увеличивается относительно некоторого выбранного уровня, фотоэлемент, соединенный системой реле, подает свежую питательную среду.

Для глубинного культивирования бактерий с аэрацией в промышленных и лабораторных условиях применяют биореакторы или ферментеры. Ферментерыпредставляют собой герметические котлы, в которые заливается жидкая питательная среда. Ферментеры снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную температуру, оптимальную рН и редокс-потенциал, дозированное поступление необходимых питательных веществ. Кроме того, они продуваются стерильным воздухом и в них установлены мешалки, с помощью которых среда постоянно перемешивается.

Непрерывное культивирование широко используется в промышленной микробиологии. Кроме того, оно используется при проведении физиологических, биохимических, генетических исследований, так как при данном культивировании поддерживается постоянство плотности популяции и концентрации всех компонентов питательной среды.

Однако, часто для изучения процессов обмена веществ необходимо, чтобы все клетки суспензии делились одновременно (синхронно). Культуры. в которых все клетки находятся на одинаковой стадии клеточного цикла и делятся одновременно, называются синхронными. Синхронизировать деление какой-нибудь популяции можно с помощью различных искусственных приемов, таких как изменение температуры, воздействие света (для фототрофных микроорганизмов), ограничение количеств питательных веществ или пропускание микроорганизмов через специальный фильтр, чтобы получить клетки одного размера. Но синхронизированная культура после 2-3 генераций переходит к асинхронному делению.

Культивирование иммобилизованных клеток микроорганизмов находит широкое применение в биотехнологии, а именно в производстве ценных органических веществ, в деградации вредных производственных соединений и промышленных отходов с целью очистки сточных вод от загрязнений.

Методы иммобилизации клеток основаны на способности микроорганизмов к адсорбции на твердых поверхностях. Существуют химические, механические и физические методы иммобилизации микроорганизмов.

Химический способ заключается в образовании ковалентной связи между какой-то из функциональных групп на поверхности клетки и носителем. Этот метод применяется редко, так как клетки в этом состоянии могут терять активность.

Механический метод основан на полимеризации какого-либо мономера, смешанного с суспензией бактерий. В результате микроорганизм оказывается заключенным в ячейку, которая ограничивает его перемещение. но не препятствует поступлению питательных веществ. Чаще всего в виде носителя используется ПААГ полиакриламидного геля. В настоящее время разрабатываются методы иммобилизации клеток путем их включения в белковые мембраны с использованием коллагена, козеина, миозина и других белков или полипептидов. Мембраны с иммобилизованными клетками сворачивают в рулон и помещают в колонку, через которую пропускают субстрат.

Сл. 10. Физический метод иммобилизации заключается в адсорбции микроорганизмов на поверхности различных синтетических пористых материалов.

Иммобилизованные клетки сохраняют высокую ферментативную активность, что позволяет использовать их в непрерывно действующих технологических процессах. При этом также облегчается выделение продуктов биосинтеза.

Источник

Основные фазы роста микроорганизмов

ГЛАВА 8. РОСТ МИКРООРГАНИЗМОВ

Обмен веществ в микробной клетке сопровождается биосинтезом белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и других соединений. В результате этих процессов увеличиваются размеры и биомасса клетки, что определяется как рост. Увеличение численности клеток в процессе их деления называют размножением. Интенсивность роста определяется путем деления биомассы на численность клеток в единице объема через определенные промежутки времени.

Бактерии, размножающиеся в замкнутом объеме питательной среды, представляют собой микробную популяцию. В лабораторных условиях и на производстве микробные популяции культивируют периодическим или непрерывным методом.

8.1. ПЕРИОДИЧЕСКОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ. КРИВАЯ РОСТА

Периодическим культивированием называют размножение микроорганизмов в замкнутом объеме питательной среды. Если в процессе культивирования в среду не добавлять питательные вещества и не выводить продукты жизнедеятельности, то рост микроорганизмов будет продолжаться лишь до тех пор, пока содержание какого-либо компонента не будет исчерпано. Рост микроорганизмов в такой замкнутой системе подчиняется определенным закономерностям и описывается так называемой «кривой роста», выражающей зависимость логарифма числа клеток от времени культивирования (рис. 23).

Рис. 23. Кривая роста микробной популяции в периодических условиях

На типичной кривой роста можно различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности:

• I — лаг-фаза (или фаза задержки роста);

• II — экспоненциальная (или логарифмическая);

• IV — фаза отмирания.

Лаг-фаза охватывает промежуток времени от момента внесения инокулята (посевного материала) до начала размножения микроорганизмов. Во время лаг-фазы число клеток или совсем не увеличивается, или нарастает очень незначительно. Задержка роста в начале лаг-фазы объясняется адаптацией к новым условиям. Тем не менее этот период характеризуется повышенной метаболической активностью: в клетках возрастает содержание РНК и общего белка, синтезируется ряд ферментов. Наблюдается заметное увеличение размеров клеток — они в 3— 5 раз больше обычных. Длительность лаг-фазы зависит от вида микроорганизма, состава питательной среды, количества и возраста вносимого инокулята. Лаг-фаза сокращается при использовании полноценной среды и молодого инокулята.

Иногда в периодической культуре может наблюдаться наличие двух лаг-фаз — диауксия. Это явление двухфазного роста в 1942 г. впервые описал французский ученый Жак Моно на примере поочередного использования двух разных углеводов кишечной палочкой. При культивировании кишечной палочки на среде, содержащей глюкозу и сорбит, клетки сначала потребляют глюкозу, тогда как синтез ферментов, необходимых для расщепления сорбита, подавляется. Эти ферменты синтезируются лишь после того, как вся глюкоза будет израсходована.

Экспоненциальная (или логарифмическая) фаза характеризуется максимальной и практически постоянной скоростью роста клеток. Число клеток в этой фазе возрастает в геометрической прогрессии. В этой фазе рост культуры сбалансирован: питательные вещества субстрата и продукты жизнедеятельности не лимитируют размножение микроорганизмов.

В экспоненциальной фазе роста, длительность которой для многих культур микроорганизмов на жидких средах невелика, питательные вещества быстро потребляются, накапливаются вредные продукты обмена, снижается интенсивность синтеза внутриклеточных компонентов. Все это приводит к замедлению роста культуры и переходу ее в следующую фазу — стационарную.

Стационарная фаза соответствует периоду, когда число жизнеспособных клеток, достигнув максимума, перестает увеличиваться. Многие клетки еще продолжают делиться, но количество вновь образующихся клеток равно количеству погибающих. При этом общая численность микробной популяции не изменяется. К концу стационарной фазы условия роста продолжают ухудшаться и культура переходит в завершающую фазу.

Фаза отмирания характеризуется массовой гибелью микробных клеток. Скорость гибели клеток намного опережает скорость их деления. В сложившихся неблагоприятных условиях выживают лишь единичные особи, появляются так называемые инволюционные формы, не дающие потомства.

Особенности периодического культивирования

Различают два основных способа культивирования микроорганизмов — периодическое и непрерывное. При периодическом культивировании клетки помещают в закрытый сосуд определенного объема, содержащий питательную среду, и задают начальные условия. Развитие культуры приводит к постепенной смене условий существования микроорганизмов: увеличивается плотность популяции, снижается концентрация питательных веществ и накапливаются продукты обмена. Периодическую культуру можно рассматривать как замкнутую систему, которая проходит разные фазы своей жизни (рис. 5.5, а).

Рис. 5.5. Типичные кривые роста:

а — при периодическом культивировании; б — диауксия на среде, содержащей два доступных питательных субстрата

Каждая фаза характеризуется определенными физиологическими параметрами. Лаг-фаза — это фаза «привыкания» клеток к среде, при этом происходят увеличение количества ДНК и РНК и индукция синтеза соответствующих ферментов. Лаг-фаза удлиняется, если брать старый посевной материал и переносить клетки в совершенно новую по составу среду. Лаг-фаза сокращается (или может совсем отсутствовать), если активные молодые клетки перенести в свежую среду того же состава и той же температуры. На средах, содержащих смесь субстратов, наблюдается диа- уксия, при которой после исчерпания одного субстрата культура переходит во вторую лаг-фазу для подготовки к потреблению другого субстрата (рис. 5.5, б). В экспоненциальной (логарифмической) фазе клетки растут и делятся с максимальной скоростью, их рост не ограничен. Обычно такие клетки используют в биохимических и физиологических исследованиях. По мере исчерпания субстратов и накопления продуктов обмена скорость роста снижается (наступает фаза замедления роста) и культура переходит в стационарную фазу, в течение которой процессы деления и отмирания клеток в популяции находятся в динамическом равновесии, когда процессы деления и отмирания клеток в популяции уравновешены. Для бактерий эта фаза достигается при концентрации в среднем 109 клеток/мл, для водорослей и простейших — 106 клеток/мл. Когда исчерпание питательных веществ и накопление продуктов метаболизма достигают неких пороговых концентраций, начинается фаза отмирания и число клеток в популяции постепенно снижается. Фаза отмирания обычно тоже имеет логарифмический характер.

Для проведения расчетов р принимались некоторые допущения, при которых скорость изменения плотности клеток в саморазмножающейся системе пропорциональна самой плотности, т.е. изменение в экспоненциальной фазе роста следует кинетике реакций первого порядка. Тогда

Периодическое культивирование

В процессе культивирования микроорганизмов периодическим способом, как указывалось ранее, можно выделить несколько периодов роста (рис. 2.19).

В первый период, после внесения в среду посевного материала (лаг-фаза), происходит процесс приспособления посевной культуры к новой среде. Численность популяции в эта время не увеличивается (а в некоторых случаях даже снижается). Состояние популяции в лаг-фазе формально можно описать так:

(для т, лежащего между 0 и т1).

Предполагается, что в период лаг-фазы микробные клетки не потребляют субстрата, но метаболическая активность клеток проявляется в повышении содержания белка и РНК (при постоянстве содержания ДНК), а также в увеличении объема клеток, который в общем виде может быть выражен с помощью уравнения

По достижении определенных соотношений между величинами поверхности клетки и ее объема происходит деление клетки, вследствие чего численность популяции начинает увеличиваться с возрастающей скоростью, которая для данной фазы роста культуры, называемой переходной, описывается соотношением

Интегральная зависимость, описывающая участок кинетической кривой роста между т1 и т2, имеет вид

Увеличение скорости роста популяций в переходной фазе идет до предела, определяемого формально достижением параметром ф величины, равной единице, после чего скорость роста начинает выражаться зависимостью

(для т между т2 и т3), откуда интегральная форма представляет экспоненциальную функцию

Эта фаза роста носит название экспоненциальной, или фазы логарифмического роста. Для оценки скорости роста биомассы часто пользуются величиной удельной скорости роста u.

В качестве характеристики растущей культуры, находящейся в этой фазе, используют термины «время удвоения» и «время генерации» q, рассчитываемое по уравнению

Однако такой характер роста популяции, который в первом приближении может быть описан экспоненциальной зависимостью, наблюдается в течение ограниченного периода времени, так как по мере увеличения биомассы все отчетливее проявляется тенденция к замедлению скорости роста. Для такого участка кинетической кривой роста популяции, называемого фазой затухающего роста культуры, может быть использовано дифференциальное уравнение для скорости роста

и его интегральная форма для описания изменения концентрации биомассы во времени

(для интервала времени между т3 и т4).

Снижение скорости роста по мере приближения X к значению Х4 происходит вплоть до достижения нулевого значения, которое характеризует вступление популяции в стационарную фазу: X = X4

(для т, лежащих между т4 и т5).

По завершении фазы стационарного роста начинается фаза отмирания, или фаза дегенерации, культуры, характеризующаяся уменьшением численности популяции.

Приведенная выше система уравнений может быть использована только для описания конкретной кинетической кривой роста, полученной в результате эксперимента, но не в состоянии служить основой для прогнозирования процесса, так как в приведенных зависимостях в качестве параметров (Х1, …, Х4; т1, …, т5) вводятся конечные значения концентрации биомассы и времени. В настоящее время еще нет общепринятой математической модели роста популяции, которая достаточно точно описывала бы кинетику накопления биомассы в условиях периодического культивирования и содержала бы минимальное число эмпирических коэффициентов. В наибольшей степени этим требованиям отвечает модель Н. И. Кобозева, использование которой при изучении кинетики роста популяции дает обнадеживающие результаты. Интегральная форма предложенного им уравнения, описывающего кинетическую кривую роста популяции, имеет вид

Это уравнение является наиболее общим выражением для роста популяции, и в зависимости от частных условий (обратимое или необратимое размножение, рост популяции с исчерпыванием субстрата или при поддержании его количества на постоянном уровне) уравнение приобретает соответствующую форму и дает различное выражение для величины концентрации биомассы.

Основной недостаток периодического способа — цикличность и постоянное изменение условий культивирования, что затрудняет контроль и регулирование параметров процесса.

Большие возможности для повышения эффективности производства заложены в непрерывном способе выращивания.

Источник